遺伝子改変による糖輸送担保の構造と機能およびインスリン作用の解析

• Project/Area Number: 03671138
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: 内分泌・代謝学
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 岡 芳知 東京大学, 医学部・(病)第三内科, 助手 (70175256)
• Project Period (FY): 1991
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1991)
• Budget Amount: ¥2,900,000 (Direct Cost: ¥2,900,000); Fiscal Year 1991: ¥2,900,000 (Direct Cost: ¥2,900,000)
• Keywords: グルコ-ストランスポ-タ- / 構造と機能 / 変異遺伝子 / トランスフェクション

Research Abstract

すべての哺乳動物細胞にはグルコ-スを細胞外から取り込む糖輸送活性が認められるが、水溶性のグルコ-スがリン脂質の二重層である細胞膜を通過する際には、グルコ-ストランスポ-タ-(糖輸送担体)と呼ばれる膜蛋白の介在が必要である。我々は糖輸送担体のサブタイプであるGLUT1の412位のトリプトファンをロイシンに置換した変異糖輸送担体の遺伝子を作製し、CHO細胞に発見させ、その糖輸送活性およびグルコ-ス結合を検討した。
サイトカラシンBによる標識は、正常トランスポ-タ-の約60%と低下しているものの認められ、412位がトリプトファンでなくても共有結合は生じたのであった。しかし、このミュ-タントでは糖輸送活性が著明に低下しており、その活性低下は2ーデオキシグルコ-ス0.1mMのみならず、10mMでも同様に認められた。なお、細胞膜への発現量は、正常トランスポ-タ-の発現量とほぼ同様であることが、Cell surface labelingの方法により確認できた。種々のグルコ-スアナログを用いた検討から、このミュ-タントのグルコ-ス結合能は細胞内から結合する場合に低下しており、412位のトリプトファンがトランスポ- タ-が内開きの形をとった時のグルコ-ス結合部位、あるいはその近傍に存在することを示唆していた。
さらに糖鎮の役割を検討するため、45位のアスパラヂンをチロシンなど他のアミノ酸に置換した糖輸送担体を発現させて、糖鎖のない場合の糖輸送活性を検討した。この結果、糖鎖は糖輸医担体のグルコ-スに対する親和性を高めて高い糖輸医活性に寄与していることが明らかとなった。

Research Products

• [Publications] 片桐,浅野,柴崎,林,佃,石原,赤沼,高久,岡: "Substitution of for tryptophan412 does not abolish cytochalasin B labeling but markedly decrease the intrinsic activity of GLUTI glucose transporter." J.Biol.Chem.266. 7769-7773 (1991)
• [Publications] 石原,浅野,片桐,林,佃,柴崎,矢崎,岡: "The glucose transport activity of GLUTI is markedly decreased by substitution of a single amino acid with a different charge at residue 415." Biochem Biophys Res commun.176. 922-930 (1991)
• [Publications] 林,浅野,柴崎,佃,片桐,石原,高久,岡: "Altered expression of glucose transporter isoforms with aging in ratsーSelective decrease in GluT4 in the fat tissue and skeletal muscle." Diabetologia. 34. 477-482 (1991)
• [Publications] 浅野,柴崎,林,佃,片桐,石原,矢崎,岡: "Expression of the GLUTI glucose transporter increases thymidine uptake in CHO cells at low glucose concentraions." Cancer Res.51. 4450-4454 (1991)
• [Publications] 佃,浅野,林,片桐,石原,高久,岡: "Peptideーbased radioimmunoassay specific for GLUTI glucose transporter." Diabetes. 40. 315-318 (1991)
• [Publications] 浅野,片桐,高田,林,石原,犬飼,佃,菊池,平野,矢崎,岡: "The role of Nーglycosylation of GLUT1 for glucose transport activity" J.Biol.Chem.266. 24632-24636 (1991)