酵母チロシンキナ-ゼの単離・精製と細胞周期の調節における役割の解析

Research Project

Project/Area Number	03680221
Research Category	Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	分子遺伝学・分子生理学
Research Institution	Kobe University
Principal Investigator	深見泰夫神戸大学, 遺伝子実験施設, 助教授 (00156746)
Project Period (FY)	1991
Project Status	Completed (Fiscal Year 1991)
Budget Amount *help	¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000) Fiscal Year 1991: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
Keywords	蛋白質リン酸化反応 / 細胞周期 / cdc2キナ-ゼ / PCR法 / 遺伝子クロ-ニング / 遺伝子発現
Research Abstract	細胞増殖・細胞周期の進行にはcdc2遺伝子産物が必須の働きをしていることがヒトから酵母に至る真核生物で広く観察されている。cdc2遺伝子産物はセリン/スレオニンキナ-ゼであるが、チロシンリン酸化によってその活性が制御されていることから、細胞周期の調節にチロシンキナ-ゼによるリン酸化反応が重要な役割を担っていることが考えられる。本研究では、遺伝子解析が容易な酵母を用いて、cdc2キナ-ゼの活性調節に関与する可能性のあるチロシンキナ-ゼを単離・精製し、その遺伝子をクロ-ニングすることを目的とした。これまでの予備実験として、チロシンキナ-ゼに特異的な阻害ペプチドを用いた解析から、酵母及びアフリカツメガエル卵母細胞の抽出液においてチロシンキナ-ゼ活性を同定し、また、阻害ペプチドの標的配列を利用したPCR法によって酵母チロシンキナ-ゼの候補をいくつかクロ-ン化していた。今回の実験によってアフリカツメガエル卵母細胞からは、cdc2キナ-ゼのチロシンリン酸化部位に相当するペプチドを基質とするチロシンキナ-ゼをほぼ単一にまで精製することに成功した。しかし、同様の酵素の酵母からの精製にはまだ成功していない。一方、PCR法によって得られたクロ-ンのうち最もチロシンキナ-ゼに近い配列を持つものは酵母第8染色体上にあり、第8染色体ではλファ-ジの製列クロ-ンバンクが得られていることから、PCR産物をプロ-ブにしてこのキナ-ゼ遺伝子を同定することができた。現在その全一次構造の決定、発現実験、並びに、遺伝子破壊を行なっている。