Exon Trapping法ー染色体DNAからの翻訳領域の取得法

• Project/Area Number: 03808035
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: 分子遺伝学・分子生理学
• Research Institution: Japanese Foundation For Cancer Research
• Principal Investigator: 佐藤 孝明 (財)癌研究会, 癌研究所・生化学部, 研究員 (30225958)
• Project Period (FY): 1991 – 1993
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1992)
• Budget Amount: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 1992: ¥300,000 (Direct Cost: ¥300,000); Fiscal Year 1991: ¥600,000 (Direct Cost: ¥600,000)
• Keywords: exon trapping / tumor suppressor gene / ゲノムプロジェクト / expressed sequence / スプライシングベクター / 第17番染色体 / tag site / Exon Trapping / ゲノム プロジェクト / 染色体地図 / スプライシング

Research Abstract

本研究の目的はスプライシングベクターを用いたexon trapping法を確立することによりゲノムDNAから成熟型mRNAとして転写される未知のexonを効率よく単離することにある。われわれはSV40のearly promoterとHIVtat遺伝子のスプライシングカセットをもつスプライシングベクラーpSPLIを用いて、第11番染色体11p15及び第17番染色体上にそれぞれマップされたコスミドクローン(63クローン)についてexon trappingを実施した。その結果、56クローン(90%)から平均サイズ約100bpの未知のexon配列をRT-PCR法により単離することができた。更に、第17番染色体上にマップされたコスミドクローンから得られたPCR産物を解析した結果、6クローンについてopen reading frameがとれ、しかも種を越えて高い保存性のあることが確認された。また、それらの1クローンについてcDNAを単離し、コスミド、cDNA、exonのDNA配列を比較検討した結果、exon trapping法で得られたユニークな配列はcos7細胞のスプライシング機構によって正確にスプライシングされたexonであることが明らかとなった。一方、問題点としては、スプライシングベクター内にcriptic siteが存在するためにfalse positiveのexonが誘導されることがある。
これらの結果から、exon trapping法はゲノムDNAより直接exonを単離するための非常に有効な手法であるばかりでなく、得られたexonをプローブとして完全長のcDNAの単離が可能である。また、この手法は、positional cloning法による遺伝性疾患や癌抑制遺伝子単離の際にも有効であるとともにtranscriptioanal mapの作成も可能で、cDNAプロジェクションと並んでゲノム解析に大きな貢献が期待される。