細胞内カルシウム動態に関わる新規機能分子の構造と機能の解析

• Project/Area Number: 03F03778
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 外国
• Research Field: 神経化学・神経薬理学
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 御子柴 克彦 東京大学, 医科学研究所, 教授
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): PRIORI Giuseppina 東京大学, 医科学研究所, 外国人特別研究員
• Project Period (FY): 2003 – 2004
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2004)
• Budget Amount: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 2004: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
• Keywords: IP_3R / IRBIT / NBC / リン酸化 / プルダウン実験 / 免疫組織 / ビアコア装置 / 細胞内pH

Research Abstract

イノシトール三リン酸レセプター(IP_3R)は細胞の小胞体膜に存在しIP3による情報伝達で細胞内にカルシウムを放出する重要なチャネルレセプターである。当研究室ではこのIP3Rが受精、卵の活性化、ニューロンの突起伸展、欠損動物はてんかんを起こすこと、脳の可塑性に関わることを明らかにしてきた。
そこで私は新規に見いだされたIP_3Rに結合するタンパク質であるアービット(IRBIT)およびそのIRBIT結合タンパク質のナトリウム/炭酸水素イオンの共トランポーター(NBC)の結合部位の同定および生理学的機能解明を行った。
IRBITとNBCが結合する際、IRBITはリン酸化されていることが必須条件であることが明らかとなった。次にどのリン酸化部位が結合に重要であるかを検討した。IRBITのN末端付近の52,58,62,64,66,68,70,71,72,74,76,77,80,90,97番目のセリンをアラニン残基にしたポイントミューテーションを用いた。その結果、第68,71,74,77番目のセリン残基を改変したものが結合しないことをプルダウン実験より明らかにした。このリン酸化IRBITとNBCの結合はさらにビアコア装置を使って詳しく解析した。NBCには3種類のアイソフォームが存在し特異的認識抗体を供与または購入し、免疫組織で組織内および細胞内での局在を検討した。IRBITに結合するNBCは小脳に特徴的な局在が観察された。IRBITはアフリカツメガエルの卵母細胞での強制発現系ではNBCを膜に輸送しトランスポーター活性を7倍以上も上昇させることを明らかにした。さらにこのNBCの活性を哺乳類の細胞で測定するために細胞内pH変化を指標に検討する系を立ち上げた。