| Project/Area Number |
04220204
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
千葉 誠哉 北海道大学, 農学部, 教授 (30001449)
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| Project Period (FY) |
1992
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1992)
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| Budget Amount *help |
¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000)
Fiscal Year 1992: ¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000)
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| Keywords | アイソトープ効果 / 親和標識 / 活性部位 / カルボヒドラーゼ |
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| Research Abstract |
(1)カルボヒドラーゼの加水分解反応に対するアイソトープ効果を調べた。酵素合成した[1,1'^<-2>H]-Iso-maltoseにに数種のα-グルコシダーゼおよびグルコアミラーゼを作用させ、速度パラメータを求め、[1,1'^<-1>H]-Isomaltoseに対する値と比較した。K_m値には変化が認められず、V_<max>のみが大きくなった。これらの結果はα-第二次アイソトープ効果の一例と考えられ、カルボニウムイオン中間体を経由する反応を示唆している。
(2)自殺基質による糸状菌α-グルコシダーゼの親和標識反応を解析し、修飾部位(触媒基)を推定した。合成したConduritol B epoxide(CBEと略)を本酵素に作用させると、擬一次的に活性が減少した。この失活はMichaelis中間体経由のものであることが判明し、本酵素とCBEが等モルで反応することが認められた。部分修飾酵素のMaltoseに対する速度パラメーターを調べたところ、K_m値は変化せず、K_0のみが低下していた。拮抗阻害剤であるTrisにより、失活反応が完全に防御された。失活のpH依存性から得られたpK値は基質水解反応における酸性側の活性解離基(-C0O^-のpKe値と一致することから、CBEは解離型のカルボキシル基(触媒基)に結合すると推定された。CBEとカルボキシル基の間に形成されたエステル結合を加水分解し、遊離するInositolをscyllo-Inositolと同定した。CBE処理した酵素をLys-C Protease消化し、CBE標識ペプチドを得た。このペプチドの配列解析を行なったところ。Asp^<224>のみの収量が低下していた。NH_2OH処理によりCBEとカルボキシル基間のエステル結合を切断し、再び配列分析に供すると、収率の回復が認められた。従ってCBEの標識部位はAsp^<224>であり、この残基が本酵素の触媒基の一つであることが判明した。
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