| Project/Area Number |
04225226
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
岩永 貞昭 九州大学, 理学部, 教授 (90029942)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
川畑 俊一郎 九州大学, 理学部, 助手 (90183037)
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| Project Period (FY) |
1992
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1992)
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| Budget Amount *help |
¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 1992: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
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| Keywords | 金属プロテアーゼ / 合成ペプチド基質 / クサリ蛇毒 / 出血因子 / 血栓性因子 / サーモライシン / 一次構造 / エンドプロテアーゼ |
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| Research Abstract |
本研究では、本属プロテアーゼの中で比較的精製が容易で、かつ大量に分離が可能な蛇毒亜鉛プロテアーゼをとりあげ、このエンドプロテアーゼの構造と觸媒活性基を明らかにすることを目的としている。具体的には、このプロテアーゼの基質と阻害剤を開発し、活性部位残基を同定し、結晶のX線回析による立体構造の解明を通して、酵素活性部位のミクロ環境を明白にする。本年度は、主に基質の開発に焦点を絞って進めた。
ハブ毒の出血性、非出血性の金属プロテアーゼ及びPussell's viper毒の凝固X因子活性化酵素(RVV-X)は、サーモライシンや哺乳類コラゲナーゼなどとは一次構造上相同性などのアミノ酸配列をペプチド領域内にもつ分子内蛍光消光基質(蛍光基にアミノベンゾイル基(Abz)、消光基にジニトロベンジルアミド基(Dna)をもつ)を10年合成し、その有用性を検討した。
その結果、これらペプチド合成基質を用いた蛇毒金属プロテアーゼの高感度かつ簡便なアッセイ法を確立できた。フィブリノーゲン切断部位周渡配列を含むAbz-Ser-Pro-Met-Leu-Dnaは、ハブ毒出血因子(HR1A及びHR2a)によっても最も高いkcat/km値で切断されたが(切断部位はPro-Met)、サーモライシンはこの基質に対して、約1/30の活性しか示しなかった。マムシ科・クサリヘビ科の蛇の粗毒(7種)もこの基質を強く水解し、この活性はEDTAによって完全に阻害された。一方、RVV-XはP_1位にArgを好み、Abz-Gly-Phe-Arg-Leu-Leu-Dnaを最も良く水解した。また、今回開発した高感度アッセイ法により蛇毒金属プロテアーゼとサーモラシインの間、さらに出血因子とRVV-Xとの間に明白な基質特異性の差のあることが明らかとなった。
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