耐塩性C_4植物のナトリウムポンプ遺伝子のクローニングと機能解析

• Project/Area Number: 04273208
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 間藤 徹 京都大学, 農学部, 助手 (50157393)
• Project Period (FY): 1992
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1992)
• Budget Amount: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000); Fiscal Year 1992: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
• Keywords: 耐塩性 / 塩生植物 / ナトリウムポンプ / 液胞膜

Research Abstract

耐塩性の強い塩生植物ホソバノハマアカザ胚軸から誘導した培養細胞は耐塩性をもたなかった。この細胞をNaC1を含む培地で継代培養することで200mM NaC1存在下でも生育可能な細胞を得た。この細胞と対照細胞の耐塩性機構を比較検討したところ、液胞膜のナトリウムポンプ活性に顕著な違いが認められた。そこで耐塩性選抜細胞および緑葉から液胞膜ナトリウムポンプを精製することを試みた。
野性細胞および選抜細胞から調製した液胞膜からタンパク質を抽出し2次元電気泳動を行ったところ、高分子タンパク質が抽出されにくいことが判明した。そこで高分子膜タンパク質を可溶化するための界面活性剤の検討を進めたが、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)以外には有効な界面活性剤は見つからなかった。このことは生理活性を有する状態でナトリウムポンプを可溶化することが出来ないこと、混存する他のタンパク質を容易に除去出来ることを意味する。液胞膜を1%C12E8で洗浄した後1%SDSで可溶化電気泳動し、野性株液胞膜には存在しない170、100KDの2種のペプチドが得られた。同時に緑葉から液胞膜を調製しそこから全膜タンパクを可溶化抽出しこれを抗原としてウサギを免疫し坑血清を得た。この坑血清は抗体価は低かったがナトリウムポンプを阻害し、ナトリウムポンプを抗原として認識すると判断した。この抗体を用いてウエスタンブロットを行ったところ、170KDタンパク質と反応し、このタンパク質がナトリウムポンプの一部であると考えられた。
また緑葉液胞膜から1%C12E8で可溶化されてくるタンパク質に、ナトリウムポンプの特異的阻害剤アミロライドをリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーと反応するタンパク質が検出された。今後このタンパク質の性質の解明を進める。