アコニチン中毒心筋障害の毒性発現機構に関する免疫組織化学的研究

• Project/Area Number: 04670346
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Legal medicine
• Research Institution: Teikyo University
• Principal Investigator: 森 啓 帝京大学, 医学部, 講師 (30174361)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高取 健彦 東京大学, 医学部, 教授 (30001928)
• Project Period (FY): 1992
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1992)
• Budget Amount: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000); Fiscal Year 1992: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
• Keywords: アコニチン / HPLC / ELISA

Research Abstract

トリカブトに含有されるアルカロイドのなかで強い毒性を有するものはアコニチン、メサコニチン、ヒパコニチン、エゾアコニチンであるがこれらのアルカロイドが分離可能なHPLCの条件をまず検討した。Puresil 5μ C_<18> 120A 4.6×150mm(Waters)カラムを用いて、溶離液にリン酸緩衝液pH2.5:MeOH=3:2を使用し、250nmのUVで検出することにより、4種類のアルカロイドが定量下限値50ng/mlで測定することができた。
次にELISAであるが、アコニチンと無水グルタル酸との反応生成物をカルボジイミドを用いてBSAと結合させた。アコニチン・BSAをフロイント完全アジュバントとエマルジョンを作り家兎に免疫し抗血清を得た。ELISA用抗原をアコニチン・KLHとして、マイクロプレートによるELISAを行い力価を測定した。ポリスチレン製プレートを蛋白濃度100μg/mlのアコニチン・KLHでコーテイング後、10%正常ヤギ血清でブロッキングを行い、ついで希釈した抗血清を反応させた。その後ペルオキダーゼ標識の抗ウサギIgGを1:10,000にPBSで希釈し感作した。発色はο-フェニレンジアミン(pH5.0クエン酸緩衝液)を基質として、H_2O_2の存在下で行なった。その結果ODIを示す希釈倍率は1:1,000であった。次にアコニチン、メサコニチン、ヒパコニチン、エゾアコニチンを用いて50%インヒビションの測定を行なったが、3μg/wellの濃度でもインヒビションがかからなかった。これはELISA用抗原と免疫用抗原とが強く交叉反応性を示すことによるものと考えられる。
以上のことからHPLCでは感度よくアコニチン系アルカロイドを分離定量することが可能となったが、ポリクローナル抗体を用いたELISAによるアコニチンの検出はきわめて困難であった。したがって、今後モノクローナル抗体の作製を試み、免疫組織学的検討を考えている。