| Project/Area Number |
04670394
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| Research Category |
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
内科学一般
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
TANI Kenji 横浜市立大学, 医学附属浦舟病院第一内科, 助教授 (20094310)
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| Project Period (FY) |
1992 – 1993
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1993)
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| Budget Amount *help |
¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000)
Fiscal Year 1993: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 1992: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000)
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| Keywords | MCP-1 / baculovirus system / ヒト単球遊走因子 / MCP1 / バキュロウイルス / リコンビナントウイルス / 異種タンパク発現系 / 0-グリコシレーション |
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| Research Abstract |
昨年来、バキュロウイルス発現系を用いたリコンビナント蛋白産生系で、hMCP-1の発現実験を行ってきた。その結果、感染細胞上清中に10〜20mug/1と多量にhMCP-1が分泌されていることが判明した。これを基に以下の実験を行った。
(1)糖鎖修飾の解析
結合型の糖鎖形成を阻害するツニカマイシン下で培養した細胞から発現するhMCP-1の分子量は変化は認められない。ゴルジ体機能を阻害するモネンシン従つてで培養した細胞から発現するhMCP-1は一11kDのmajorbandのみである。以上の結果から、hMCP-1の分子量の多様性は、11kDのコア蛋白に対する。結合型の糖鎖修飾によるものと考えられた。更にシアリル酸エキソグリナーゼであるイノラミニダーゼ及びマンノースエキソグリカナーゼであるマンノシダーゼによりhMCP-1の分子量に変化は認められず、Galbeta1-3Gal NAcO結合部位のエンドグリカナーゼであるO-グリカナーゼにより11.5kDのminor bandが消失することから、hMCP-1のomicron結合型の糖鎖修飾はGalbeta1-3Gal NAcであるが、シリアル酸の重合が認められない点で異なることが判明した。
(2)hMCP-1の精製及びN末端解析
培養液を直接CM-Sephadenイオン交換カラムで溶出し、その溶出液をSDS-PAGEで解析したところ、ほぼ単一な11kDのバンドが得られた。100mlの培養液より1.4mgのhMCP-1精製蛋白が得られ、この精製蛋白のN端アミノ酸解析より、cDNAより推測されるhMCP-1のN端側29塩基が欠如していた。hMCP-1は、その分泌の際にN端側23塩基がシグナルペプチドとして切除されると報告されているが、本発現系ではさらに6塩基が切除されており、本解析におけるhMCP-1の低活性は、そのN端側の違いによるものである可能性が示唆された。
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