| Project/Area Number |
04670532
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| Research Category |
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Circulatory organs internal medicine
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
由井 芳樹 京都大学, 医学部, 助手 (20158330)
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| Project Period (FY) |
1992
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1992)
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| Budget Amount *help |
¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
Fiscal Year 1992: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
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| Keywords | EDRF / NO / 血管 / 弛緩 / 内皮細胞 / cDNA / クローニング / NO合成酵素 |
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| Research Abstract |
ラット腹腔の活性化マクロファージからNO合成酵素の誘導型の蛋白を均一に精製した。この蛋白質をリシルエンドペプチダーゼAP-Iで分解処理しペプチドを逆相HPLCで分離、分取した。
ペプチドを473A(AB社)ペプチドシーケンサーで解析し各ペプチドのアミノ酸配列を決定しデータベースでホモロジー検索を行ったが既知のペプチドとのホモロジーはなかった。
上記のペプチドに対するDNAプローブをDNA合成した。
活性化マクロファージからCaCl法によりRNAを作成し更にmRNAを精製した。このmRNAからoligo dTをプライマーとしてcDNAをつくりλgt10でcDNAライブラリーを作成した。
PCR法により先の合成DNAから300-500bpsのDNAを合成しランダムブリング法により^<32>Pラベルした。
このラベルしたDNAをプローブにしてcDNAライブラリーからスクリーニングし陽性クローンを得た。
さらに他のプローブを用いてスクリーニングし最終的に1クローンを得た。M13にこのクローンをサブクローンしcDNA塩基配列を決定した。次にこのcDNAを発現ベクターPC DM8に組み込みCOS7細胞にtransfectionし本酵素の発現を検討した。
COS7細胞を破壊後本酵素活性を測定すると酵素活性が測定できた。
次にこの酵素の制御を検討した結果Ca^<++>は必要であったがcalmodulinは必要としなかった。
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