| Project/Area Number |
04671512
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| Research Category |
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Hematology
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
東條 有伸 東京大学, 医科学研究所, 助手 (00211681)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小澤 敬也 東京大学, 医科学研究所, 助教授 (30137707)
浅野 茂隆 東京大学, 医科学研究所, 教授 (50134614)
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| Project Period (FY) |
1992
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1992)
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| Budget Amount *help |
¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
Fiscal Year 1992: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
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| Research Abstract |
Stem cell factor(SCF)はストローマ細胞が産生し、未分化造血幹細胞の増殖分化を支える造血因子である。SCFは本来膜結合蛋白質として合成されるが、一部は細胞膜挿入後に酵素の作用で切断され、細胞外へ分泌される。この分泌型SCFも生物活性を有することが知られている。本年度の研究計画に基づいて、われわれはマウスSCFcDNAを3'末端から順次欠失させた一連の変異体を作製し、これらを用いてSCFの構造と機能の関係を解析した。既にクローン化済みの完全長SCFcDNAを制限酵素で切断後、マングビーンヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼIIIの処理によって細胞外領域のみをコードする長さまで欠失させた。得られたSCFcDNA変異体6種類の塩基配列を決定した結果、それらはシグナルペプチドを除きN末端からそれぞれ183、179、162、149、142および133アミノ酸をコードしていた。また、C末端にはリンカー由来の数アミノ酸が付加されていた。次に、発現ベクターに組み込んだ各々のcDNAをDEAEデキストラン法でCOS細胞にトランスフェクションし、72時間後に培養上清を回収してその生物活性を以下の2つの方法で検討した。(1)MTT法を用いてヒト造血因子依存性細胞株TF-1の増殖支持活性を調べた。(2)5-FU処理マウスの骨髄細胞を標的として、IL3、EPO共存下でのhigh proliferative potentialーcolony forming cell(HPPーCFC)刺激活性を調べた。また、^<35>S-メチオニンで各cDNA導入COS細胞の培養上清を標識後SDSーPAGEを行い、アミノ酸数から予測される大きさのSCF蛋白質が合成されているかどうか確認した。結果として、まず各SCFcDNA変異体は予測されるサイズのSCF蛋白質をコードすることが確認された。さらにマウスSCFのN末端142アミノ酸残基は上述した両方の生物活性を有するが、133アミノ酸残基では失活することが判明した。従って、Asp^<134>からSer^<142>までの間にマウスSCFの活性保持に重要な配列が存在すると考えられた。
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