脳神経系細胞アストロサイトの分化誘導因子としての転写因子のクローニング

Research Project

Project/Area Number	04833019
Research Category	Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	分子細胞生物学
Research Institution	Osaka University
Principal Investigator	池中一裕大阪大学, たんぱく質研究所, 助教授 (00144527)
Project Period (FY)	1992
Project Status	Completed (Fiscal Year 1992)
Budget Amount *help	¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000) Fiscal Year 1992: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
Keywords	アストロサイト / プロモーター活性 / レトロウィルス / セルソーター / 分化因子 / 転写因子
Research Abstract	平成4年度はアストロサイトの分化とともに誘導される転写因子をクローニングするために、レトロウイルスベクターの改良とβ-ガラクトジダーゼ(β-Gal)発現細胞分取法の確立を行った。われわれは(グリア線維性酸性蛋白質)GFAPプロモーター領域の下流に大腸菌β-ガラクトシダーゼ遺伝子を連結した遺伝子を含むレトロウイルスベクターをすでに構築しており、このものが初代培養脳細胞に障害を与えることなく効率よく感染し、アストロサイト特異的にβ-ガラクトシダーゼを産生することを見いだしている。しかし、このベクターにおいてはGFAPプロモーターが上流にあるLTRプロモーターからの転写により転写干渉を受けていることが分かった。これを避けるために3′側のLTRのTATAboxに置換突然変異を導入し、ウイルス感染後のLTRプロモーター活性を無くすることに成功した。この結果、挿入プロモーターの活性が数倍上昇した。また、β-Gal活性を示す細胞を分取するために蛍光性の基質(FDG)を調製した。NIH3T3細胞にβ-Gal産生ウイルスを感染させ、生きたままFDG処理し、FACS(fluorescent activated cell sorter)を用いて蛍光性の細胞を分取したところ、95%以上の細胞にβ-Gal産生が認められた。これらの技術を合わせ用いることによりGFAPプロモーターの活性化された細胞が容易に調製できるようになった。