Fas抗原の生理作用とその情報伝達機構の解析

• Project/Area Number: 05152142
• Research Category: Grant-in-Aid for Cancer Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Osaka Bioscience Institute
• Principal Investigator: 長田 重一 財団法人 大阪バイオサイエンス研究所, 第一研究部, 研究部長 (70114428)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 須田 貴司 〃, 第一研究部, 研究員 (70250090) ; 伊藤 直人 〃, 第一研究部, 研究員 (70223170)
• Project Period (FY): 1993
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1993)
• Budget Amount: ¥10,000,000 (Direct Cost: ¥10,000,000); Fiscal Year 1993: ¥10,000,000 (Direct Cost: ¥10,000,000)
• Keywords: Fas / Fasリガンド / アポトーシス / 情報伝達 / サイトカイン / 受容体 / 細胞死

Research Abstract

動物の発生,分化過程において数多くの細胞が死ぬべく予定されており,その細胞死はアポトーシス(apoptosis)と呼ばれる機構で進行する。アポトーシスは細胞質,核の凝縮を伴い,また生化学的にはDNAの断片化を伴う過程である。ところでFasはTNF/NGF受容体群に属し,そのアゴニストとして作用する抗体は細胞のアポトーシスを誘導する。このことから,Fasは“Death factor"の受容体と考えられた。本研究はFasの本来のリガンドを同定するとともに,Fasを介したアポトーシスの情報伝達機構の解析を目的とした。まず,Fasの細胞外領域をヒトイムノグロブリンH-鎖と融合したキメラ遺伝子を構築し,動物細胞で発現し,精製した。このキメラタンパク質(mFas‐Fc)を用いて種々の細胞株を検討した結果,細胞障害性T-細胞株(CTL)であるPC60‐d10Sにおいて,Fasリガンドを発現することが認められ,かつそのCTL活性はmFas‐Fcにより阻害された。そこでd10s細胞のFACSを用いたsortingを16回繰り返すことにより,Fasリガンドをd10Sに較べ100倍大量に発現するサブラインd10S16株を樹立した。ついでこの細胞株を大量に培養し,その膜分画よりFasリガンドを分子量約4万の単一タンパク質として精製した。ついでd10S株よりcDNAライブラリーを作製し,発現クローニング法によりFasリガンドcDNAを単離した。そのアミノ酸配列から,FasリガンドはTNFと相同性を持つタイプII膜タンパク質であることが示された。一方,COS細胞を用いて発現させた組み換えFasリガンドはFasに結合し,アポトーシスにより細胞を死滅させた。この結果は,Fasリガンドは“a death factor"でありFasはその受容体であることを示している。また,FasリガンドcDNAを用いたNorthern hybridizationの解析から,Fasリガンドは活性化されたT-リンパ球での発現が認められ,CTLにおけるFasの寄与が明らかとなった。

Research Products

• [Publications] Adachi et al.: "Aberrant transcription caused by an insertion of an early transposable element in intron of the Fas antigen gene of lpr mice" Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 90. 1756-1760 (1993)
• [Publications] Itoh and Nagata: "A novel protein domain required for apoptosis:mutational analysis of human Fas antigen" J.Biol.Chem. 268. 10932-10937 (1993)
• [Publications] Ogasawara et al.: "Lethal effect of the anti‐Fas antibody in mice" Nature. 364. 806-809 (1993)
• [Publications] Suda et al.: "Molecular cloning and expression of the Fas ligand,a novel member of the tumor necrosis factor family" Cell. 75. 1169-1178 (1993)
• [Publications] Suda and Nagata: "Purification and characterization of the Fas‐ligand that induces apoptosis" J.Eep.Med.(in press). (1994)
• [Publications] Takahashi et al.: "Generalized lymphoproliferative disease(gld) in mice caused by a point mutation in the Fas ligand" Cell. (in press). (1994)