| Project/Area Number |
05255209
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
権藤 洋一 九州大学, 生体防御医学研究所, 講師 (40225678)
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| Project Period (FY) |
1993
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1993)
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| Budget Amount *help |
¥2,400,000 (Direct Cost: ¥2,400,000)
Fiscal Year 1993: ¥2,400,000 (Direct Cost: ¥2,400,000)
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| Keywords | 相同組換え / ジーンターゲッティング / ジーンコンバージョン |
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| Research Abstract |
マウスES細胞CCE株のp53遺伝子のジーンターゲッティングを行ない、4タイプの組換え導入体を得た。導入実験を独立に2回行ない、得られた全G418耐性株をサザーン法にて解析した。1回目:G418耐性57株の内、相同組換え体13株、重複相同組換え体2株、ランダム導入体35株、ジーンコンバージョン型組換え体7株。2回目:G418耐性58株中、相同組換え体21株、重複相同組換え体2株、ランダム導入体30株、ジーンコンバージョン型組換え体5株であった。ゆえに、4つの導入パターンが、ほぼ同頻度で繰り返し得られることが明らかとなった。また、ジーンコンバージョン型組換え体は全て、5′側のみが相同組換え導入のパターンを示していた。異なるES細胞TT2株にも同様の導入実験を行ない、ほぼ同じ結果が得られ、再現性も確証できた。
さらに、得られた全G418耐性株におけるベクターの導入構造を分子レベルにて解析し、次の組換え導入機序モデルを提唱することができた。()内には実際に観察された細胞株数を示している。まず、ベクターの導入は5′側の相同領域でホリデイ構造が作られる。この確率はランダムに導入してG418耐性となる場合の約半分(50/115)である。その場合、3′側相同領域でもホリデイ構造を作る確率が75%(38/50)で、2箇所の組換えにより相同組換えにより相同組換え体となる。ただし、このうち約10%(4/38)ハ、ベクターがタンデムに重複され重複相同組換体となる。さて残りの25%(12/50)では、3′側はホリデイ構造を作らずブルースクリプトも含めて、ターゲッティングベクターの5′末端と環状形で相同組換え導入される。これがジーンコンバージョン型組換え導入のモデルである。これは、Capecchiにより提唱されている1箇所の相同組換えによる「挿入型」ジーンターゲッティングに相当する。以上、組換え導入を分子レベルで解析した結果、再現性の高いジーンターゲッティング系が初めて確立でき、実験的に検証可能な遺伝子導入機序モデルも提唱できた。
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