アミノアシルtRNA合成酵素の構造解析を通して見る翻訳系の進化

• Project/Area Number: 05265222
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Japanese Foundation For Cancer Research
• Principal Investigator: 芝 清隆 財団法人癌研究曾, 癌研究所・細胞生物部, 研究員 (40196415)
• Project Period (FY): 1992 – 1993
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1993)
• Budget Amount: ¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000); Fiscal Year 1993: ¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000)
• Keywords: アミノアシルtRNA合成酵素 / 翻訳 / tRNA / PCR / ヒト / ミトコンドリア / M13ファージ / 試験管内進化

Research Abstract

本研究では、転移RNAが中心的役割を果たす遺伝情報翻訳系の起源・進化を、1-ヒトアミノアシルtRNA合成酵素の遺伝子構造の解析、および、2-イソロイシルtRNA合成酵素のより小さな「コア酵素」への変換、という2つのアプローチから追究した。本年度の研究実績は以下の通りである。
1-(1)、クロススペシーズ-PCR法を用い、クラスIIに属するグリシン、スレオニンアミノアシルtRNA合成酵素遺伝子cDNAのヒトからの分離に成功した。また、アスパラギン酸、トリプトファンtRNA合成酵素等のミトコンドリア型に相当すると思われる遺伝子断片も得ることに成功している。
1-(2)、平成4年度の研究から得られたヒト細胞質型、ミトコンドリア型イソロイシルtRNA合成酵素を大腸菌内で多量発現させる系を作成した。このうち、細胞質型の酵素については、活性発現にも成功している。
1-(3)、ヒト培養細胞より抽出したpolyA(+)mRNAを用い、ノザーンブロット実験から、2つのヒトイソロイシルtRNA合成酵素遺伝子の転写産物の大きさを決定した。
1-(4)、RACE-PCR法により、ヒトイソロイシルtRNA合成酵素遺伝子のcDNAに不足していると思われる5^,領域を得、その塩基配列を決定した。2、繊維状ファージ粒子の表面にイソロイシルtRNA合成酵素を展示する系を確立した。この系を利用し、試験管内でファージの示すtRNA結合能、アミノ酸tRNA結合能、ATP結合能を指標にした変異体イソロイシルtRNA合成酵素の選択が可能となる。