糖転移酵素および関連蛋白質の光アフィニティーラベリング

Research Project

Project/Area Number	05274209
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
Allocation Type	Single-year Grants
Research Institution	Toyama Medical and Pharmaceutical University
Principal Investigator	畑中保丸富山医科薬科大学, 和漢薬研究所, 助教授 (30111181)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	手塚康弘富山医科薬科大学, 和漢薬研究所, 助手 (70236975)
Project Period (FY)	1993
Project Status	Completed (Fiscal Year 1993)
Budget Amount *help	¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000) Fiscal Year 1993: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
Keywords	光アフィニティーラベル / ジアジリン / カルベン / 糖転移酵素 / ガラクトシルトランスフェラーゼ / シアリルトランスフェラーゼ / アビジン / ビオチン
Research Abstract	本研究の目的は、糖転移酵素群の遺伝子レベル、分子レベルでの解明を指向した光アフィニティーラベルを、独自の光アフィニティープローブを用いて実施することにある。これに向け、当該年度は当初の研究計画にしたがって、光反応性の新規糖鎖型プローブを合成し、これを用いる光アフィニティーラベルを検討した。 1.糖転移酵素として、シアリルトランスフェラーゼおよびガラクトシルトランスフェラーゼに特異的な糖鎖骨格をリガンド部分とし、これに独自に開発したジアジリン系の光反応基を導入することで、反応性の非常に強いカルベン発生型の試薬へ誘導した。さらに、試薬構造中にはビオチン部分を内蔵させ、アビジン-ビオチン相互作用系を利用して、ラベル蛋白質の高感度検出、単離精製の両段階が特異的に行なえる分子設計の光反応性新規糖鎖型プローブを合成した。 2.糖鎖構造がさらに複雑なリガンドについて、その糖鎖部分の合成段階を効率良く行なう新しい方法を検討した。ラクトサミン構造を対象として独自に開発したN-トロフルオロアセチルアミノ糖を基質とする、新しい酵素的合成法の適用を試みた。この結果、糖鎖型プローブ合成に有用な種々のN-トロフルオロアセチルラクトサミン誘導体を、収率良く合成することができた。 3.また1.で合成した試薬を用い、実際の応用段階を検討した。ガラクトシルトランスフェラーゼの光アフィニティーラベルを実施し、ラベル結果の解析にビオチンの化学発光検出法を利用することにより、ラジオアイソトープを用いないで、ラベル蛋白質の高感度検出に成功した。