骨髄移植後に出現するT細胞分画のPCRと温度勾配ゲル電気泳動法によるクローン解析

• Project/Area Number: 05670902
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Hematology
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 小林 幸夫 東京大学, 医科学研究所, 助手 (50240734)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岡本 真一郎 慶応大学, 医学部・内科, 講師 (50160718) ; 小澤 敬也 東京大学, 医科学研究所, 助教授 (30137707) ; 浅野 茂隆 東京大学, 医科学研究所, 教授 (50134614)
• Project Period (FY): 1993
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1993)
• Budget Amount: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000); Fiscal Year 1993: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
• Keywords: TCR(T細胞抗原受容体) / PCR / 温度勾配電気泳動 / 遺伝子診断 / 骨髄移植

Research Abstract

各種疾患をT細胞のレパートリィの面から検討する目的で,PCRと温度勾配ゲル電気泳動(Temperature gradient gel electrophoresis,TGGE)法による新しいクローン解析法の導入を試みた.
T細胞の抗原受容体γ鎖遺伝子V領域・J領域で共通プライマーオリゴマーが設定可能である部位を探し,そのオリゴマーセットを用いてPCRを行なった後に,65-85度の温度勾配をかけてTGGEを4時間250Vで行なった.遺伝子再構成があることが判明しているT細胞性白血病細胞株,および臨床検体で単一なバンドが検出されたが,通常の健常人末梢血のDNAではsmearしか認めなかった.白血病細胞の検出感度は0.1-1%であった.
連続希釈した検体でPCR産物の塩基配列を検討したところ,正常リンパ球に由来する再構成塩基配列をバックグラウンドとして含んでいたことから,高感度で単クローン性の腫瘍細胞を検出することができた理由は,オリゴマーの特異性が腫瘍細胞の再構成遺伝子の増幅に有利であったためではなく,PCR産物のDNA断片がサイズと塩基組成の相違によって分離できたためであると結論した.すなわち,バックグラウンドの塩基組成が異なる再構成産物は拡散により消失し,クローン性の再構成バンドだけが明瞭に観察されたと考えられた.
各種疾患での検討では,成人T細胞性白血病・リンパ腫の症例で末梢血液に異型細胞が出現していないにもかかわらず,この方法によってはじめて腫瘍細胞クローンの存在が示された例があった.従来のT細胞クローンのPCR法による臨床検体の解析では,正常リンパ球に由来するバックグラウンドの再構成産物も同様に増幅され,クローン性の再構成と区別できない欠点があったが,本法によりその点が解決された.現在までのところ骨髄移植後で異常クローンが出現した症例は認めていないが,症例を増やして検討中である.

Research Products

• [Publications] Kobayashi,Y et al.: "Detection of tumor clones with PCR and TGGE(Temperature gradient gel electrophoresis)." Int J Hematol. 57(S). 101 (1993)
• [Publications] Kobayashi,Y et al.: "HRX rearrangement in acute lymphoblastic leukemia after adjuvant chemotherapy of breast cancer." Blood. 82. 3201-3202 (1993)
• [Publications] Okamoto,S.et al.: "Allogeneic bone marrow transplantation in Japan." Bone Marrow Transplant. in press (1994)
• [Publications] Shimizu,K.et al.: "An ets-related gene,ERG,is rearrangened human myeloid leukemia with t(16;21) chromosome translocation." Proc Natl Acad Sci. 90. 10280-10284 (1993)
• [Publications] Nishikawa,M.et al.: "Changes in hematopoiesi-supporting ability of C3H10T1/2 mouse embryo fibroblast during differentiation." Blood. 81. 1184-1192 (1993)
• [Publications] Ozawa,K.et al.: "Hematopoiesis-supporting ability of a differentiaiton-inducible stromal cell line of mouse embryo fibroblasts." Bone Marrow Transplant. 12(S2). 29 (1993)