Prevotella loescheiiの免疫抑制因子遺伝子のクローン化と解析

• Project/Area Number: 05671580
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: 病態科学系歯学(含放射線系歯学)
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 斉藤 重野 日本大学, 松戸歯学部, 講師(専任扱) (60072394)
• Project Period (FY): 1993
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1993)
• Budget Amount: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000); Fiscal Year 1993: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
• Keywords: 歯周病 / Prevotella loescheii / 免疫抑制因子

Research Abstract

Prevotella loescheiiの免疫抑制因子遺伝子のクローニングに先がけて、P.loescheiiから因子の精製をHPLC-DEAE交換クロマトグラフフィーおよびゲルろ過法にて手がけた。溶出分画の免疫抑制活性はヒトリンパ球由来の培養株細胞への^3H-チミジン取り込み能の抑制を指標とした。因子はDEAEイオン交換体に吸着し、抑制活性は0.1〜0.2MNaC1濃度で溶出された。活性分画はゲルろ過法でおよそ32kDaの分子量を示した。32kDa因子は加熱処理およびタンパク質分解酵素処理に感受性であった。このタンパク質性因子はヒトのB細胞由来株細胞(BALL-1)、T細胞由来株細胞(Jurkat)および単球由来株細胞(U937)の^3H-チミジン取り込み能を供与量依存的に抑制した。また、この因子はホルボールエステルにてマクロファージに分化させたU937細胞からのIL-1分泌を抑制、さらに、Jurkat細胞からのIL-2産生抑制を示し、P.loescheiiが宿主の免疫応答を攪乱していることを示唆した。ついで、P.loescheiiからDNAを分離し、E.coli内に遺伝子バンクを作製した。このバンクからP.loescheiiの免疫抑制因子遺伝子クローンを因子タンパク質に対する抗血清で免疫学的にスクリーニングする予定であった。この時点で、因子タンパク質を精製する過程で、P.loescheiiの培養用培地中に含有されるBactopeptoneあるいはYeast extractsに由来するタンパク質と、因子タンパク質との凝集が生じてきているとの疑問を持つようになった。したがって、免疫学的に因子タンパク質クローンをスクリーニングすることは不可能となった。方法を転じて、cytolysin等、既報の塩基配列からオリゴヌクレオチドプローブをPCR法にて作製し、このプローブとハイブリダイズするP.loescheiiクローンをスクリーニングする方法を施行している。