標的遺伝子組換えによるDNA修復酵素遺伝子の機能の解析

Research Project

Project/Area Number	05680596
Research Category	Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Molecular biology
Research Institution	Kyushu University
Principal Investigator	〓輝久九州大学, 生体防御医学研究所, 助教授 (40155429)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	早川浩九州大学, 医学部, 助手 (70150422)
Project Period (FY)	1993
Project Status	Completed (Fiscal Year 1993)
Budget Amount *help	¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000) Fiscal Year 1993: ¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000)
Keywords	標的遺伝子組換え / 胚性幹細胞(ES細胞) / ジーン・ターゲティング / DNA修復酵素 / 相同定組換え / 変異マウス
Research Abstract	アルキル化剤や放射線は細胞のDNAに様々な傷をつけ、細胞を癌化させる突然変異を誘起することが明らかにされている。アルキル化剤によってDNA上に生じた傷を修復する酵素として、O^6-メチルグアニンDNAメチルトランスフェラーゼ(MGMT)が知られている。DNAの傷と突然変異および発癌の関連を明らかにし、その過程を分子レベルで解析する目的で、標的遺伝子組換えの手法によりMGMT遺伝子を欠損する変異細胞・変異マウスを作製する実験に着手した。 (1)相同的組換えの頻度を上げるため、マウスの胚性幹細胞(ES細胞)由来の遺伝子ライブラリーから単離したMGMT遺伝子の5'端領域を含む染色体DNAクローンを使用してターゲティング・ベクターを構築した。ベクターの両端にはネガティブ選別用に2種類のHSV-TK遺伝子を結合させ、また相同的組換えによって遺伝子を不活化し併せてポジティブ選択を行うため、第2エクソンの翻訳領域の中にG418耐性マーカーカセットを挿入した。 (2)ターゲティング・ベクターをエレクトロポレーションによりES細胞へ導入後、GANC存在下でG418耐性の細胞のDNAをサザンブロット解析によりスクリーニングし、目的とするクローンを選択した。現在ダブルノックアウトにより対立遺伝子の両方が不活化した細胞株(ホモ接合体)を確立する作業を行っている。また対立遺伝子の片方の遺伝子を不活化した細胞をマウスの胚盤胞に導入し、キメラマウスを経て変異マウス(ヘテロ及びホモ接合体)を得る操作を試みている。