| Project/Area Number |
05760086
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
応用微生物学・応用生物化学
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| Research Institution | Sojo University |
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Principal Investigator |
尾山 廣 熊本工業大学, 工学部, 助手 (50221700)
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| Project Period (FY) |
1993
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1993)
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| Budget Amount *help |
¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 1993: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
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| Keywords | ペプスタチン非感受性 / カルボキシルプロテアーゼ / 耐熱性酵素 |
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| Research Abstract |
Bacillus novosp.MN-32株の産生する耐熱性ペプスタチン非感受性カルボキシルプロテアーゼは、耐熱性のみならず基質特異性や阻害剤に対する挙動など非常にユニークな性質を持っている。本研究課題では本酵素の一次構造並びに触媒昨日を遺伝子レベルから解明するために、酵素遺伝子のクローニングを行った。本年度の研究成果は以下に示すとおりである。1.Bacillus novosp.MN-32株の培養上清120リットルから、各種カラムクロマトグラフィーで22mgの酵素タンパクを得た。この酵素をトリプシン、リジルエンドペプチダーゼ、サーモリシン等のプロテアーゼで限定分解し、逆相HPLCで各消化ペプチド断片を分離精製後、それらのアミノ酸配列を自動アミノ酸アナライザーにより約100残基分が決定した。この中からプローブDNA作成のためにコドン選択率の低いアミノ酸配列を2ヶ所選び、耐熱性酵素がGC含量が多いことを考慮に入れてコドンの3番目の塩基を、a)GまたはC、b)イノシンとして2種類のプローブDNAを化学合成した。プローブの標識は蛍光基質や^<32>Pで行い、酵素遺伝子のスクリーニングに用いた。2.Bacillus novosp.MN-32株の染色体DNAはSaito-Miura法を改良した方法で調整し、各種制限酵素で完全消化後、1の標識プローブDNAでサザンハイブリダイゼーションを行った。約3kbpのSalI断片に目的遺伝子があることが分かり、プラスミドpUC18の同部位に挿入後、E.coli DH5alphaを形質転換した。得られた各形質転換体からコロニーハイブリダイゼーション法で目的酵素遺伝子を組み込んだクローンを選抜し、E.coli DH5alpha/pK1株を得ることに成功した。この得られたプラスミドpK1の制限酵素地図を作成し、プローブDNAとハイブリダイズしたところ、約0.5kbpのBamHI消化断片に目的酵素遺伝子の存在が推定された。現在、その断片を含んだ領域の塩基配列を決定中である。
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