魚類シトクロムP-450cDNAを用いた環境汚染判定法の開発

• Project/Area Number: 05760165
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Fisheries chemistry
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 大嶋 雄治 九州大学, 農学部, 助手 (70176874)
• Project Period (FY): 1993
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1993)
• Budget Amount: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 1993: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
• Keywords: P-450 / 環境汚染 / 指標 / 魚 / DNA / PCR

Research Abstract

マコガレイP-450遺伝子の増幅:既に塩基配列の判明しているウナギP-450遺伝子の情報を基に、PCRプライマーを作制した。次いでマコガレイ肝臓より全DNAを抽出し、cDNAを鋳型としてPCRによりP-450遺伝子を増幅したが、目的の遺伝子は増幅しなかった。本原因として、P-450をコードする遺伝子の中に、イントロン(非翻訳部分)があるため、増幅されなかったと考えられた。よって、生きたウナギの肝臓よりmRNAを抽出後、DNAに逆転写を行った後、PCR(RT-PCR)を行った結果、約300bps付近にDNAが増幅された。よって、このDNAを精製し、ダイレクトシーケンス法によりその塩基配列を決定した。
環境調査: 九州北部博多湾内で、汚染された水域および清浄な水域よりマコガレイを計10個体釣りにより採取した。肝臓は現場で直ちに抽出して液体窒素で凍結、-80℃で保存した。肝臓の細胞分画を行い、P-450含量とその酵素活性を測定した結果、P-450含量およびP-450によって触媒されるbenzo[a]pyrene hydroxylaseの活性は、汚染魚で対象魚にくらべ有意(p<0.01)に高かった。しかし、肝臓よりmRNAを抽出しRT-PCRを行ったが目的とするDNAは検出されなかった。
以上の結果より、汚染されたマコガレイの肝臓におけるP-450含量は高く、誘導が起こっていたと考えられる。また、P-450のmRNAが検出されなかった原因は採集、凍結、保存(-80度)時にmRNAが分解されたと推定された。
本研究の結果、環境汚染によるマコガレイのP-450の誘導が明らかとなった。今後は、再度マコガレイの採取を行い、生きた魚よりmRNAを抽出、RT-PCRによってP-450mRNAの発現を明らかにして行く予定である。