| Research Abstract |
25-ヒドロキシビタミンD_324-水酸化酵素は活性型ビタミンD_3により著しい誘導される。その転写誘導は活性型ビタミンD_3がビタミンDレセプター(VDR)に結合し,さらに補助因子(核内蛋白質)とヘテロダイマーを形成後,その複合体が転写調節領域にあるビタミンDレスポンスエレメント(VDRE)に結合することによると考えられている。
我々は,24-水素化酵素遺伝子のクローニングを行い5'-上流領域についてVDREの検索を行った。プロモーター領域を5'側から順次欠失させCATベクターに組み込み腎臓由来のCOS細胞に導入し活性型ビタミンD_3によるCAT活性の誘導を調べた。その結果,[-167/-102]の領域が応答に関与することが判明した。また[-204/-129]の領域はチミジンキナーゼ,beta-グロビンのプロモーターを介して,その挿入方向に依存することなくビタミンD応答を媒介した。これらCATアッセイにより重要性が示唆された領域について既知のVDREとの相同性の比較を行い,可能性のある配列を選び,ゲルシフトアッセイに用いた。このとき,核抽出液はCOS細胞より調整し,VDR,RXRはそれぞれのcDNAからin vitro翻訳系で合成し使用した。バンドシフトは活性型ビタミンD_3,VDR,COS細胞核抽出液(またはRXR)の3成分が存在するときのみに認められた。核抽出液でもRXRを用いた場合でも,シフトしたバンドの電気泳動上の移動度は同じであった。腎臓にはRXRが存在していることを考え合わすとCOS細胞中のVDRとヘテロダイマーを形成する因子はRXRであると考えられた。
以上の結果から本酵素の活性型ビタミンD_3による誘導は[-153/-137]のAGGTGAgtgAGGGCGの塩基配列を介してなされ,このVDREにはVDRとRXRと考えられる核内蛋白質が結合することが判明した。
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