大動脈平滑筋ミオシンに存在する必須軽鎖アイソフォームの生理的機能

• Project/Area Number: 05780449
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Functional biochemistry
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 江藤 真澄 北海道大学, 理学部, 助手 (20232960)
• Project Period (FY): 1993
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1993)
• Budget Amount: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 1993: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
• Keywords: 大動脈平滑筋ミオシン / 必須軽鎖アイソフォーム / ペプチド合成 / 特異的抗体

Research Abstract

ブタ大動脈平滑筋ミオシンに存在する2種の必須軽鎖アイソフォームのうち、非筋型必須軽鎖を特異的に認識する抗体を作成する際抗原として用いる9残基ペプチド(AFVRHILSG)を合成した。合成したペプチドの純度を確認するために高速液体クロマトグラフィーを行ったところ2つの大きなピーク(p1、p2)が6:4の割合で検出された。量ピークのアミノ酸組成分析及び質量分析結果はそれぞれ目的物と同じ値であった。従ってどちらかのピークは合成中にアミノ酸残基がラセミ化して生じた複生成物であろうと予想された。
今回のように一部ラセミ化したペプチドを検出できる簡便な方法は今までに報告がない。そこでL体のアミノ酸残基のみを認識しペプチドのN末端から順に消化するロイシンアミノペプチダーゼ(LAP)を用いたラセミ化ペプチドの簡単な検出法を開発した。0.2mgのペプチドを重量比1/23のLAPで消化させたところp1は3時間で全残基が定量的に遊離したが、p2は18時間反応を行っても4残基目のアルギニン以降のアミノ酸は検出されなかった。従って、目的物はp1であり、p2 はアルギニン残基がラセミ化していると判定できた。さらにそれぞれのペプチドを抗原とし兎を免疫したところ、p1に対する抗血清はミオシンと強く反応したのに対しp2に対する抗血清はほとんど反応しなかった。この結果もp2は目的とするペプチドではないことを示し、LAPを用いたペプチド検定法の結果を支持している。
p1に対する抗血清を硫安分画、p1アフィニティーカラム、およびプロテインAカラムを用いたクロマトグラフィーで精製し得られた抗体の特異性を確認したところ、大動脈抽出液に含まれる蛋白質のうちミオシン非筋型必須軽鎖のみを認識することが示された。今後は平滑筋型必須軽鎖に対する抗体も作成し、両抗体がそろい次第血管組織内の両アイソファームの分布を調べる予定である。