ジーントラップ法による神経変異マウスの作製と表現型解析

• Project/Area Number: 05J02814
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Molecular biology
• Research Institution: Nara Institute of Science and Technology
• Principal Investigator: 重岡 稔章 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2005 – 2006
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2006)
• Budget Amount: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000); Fiscal Year 2006: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2005: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
• Keywords: ジーントラップ / ES細胞 / ノックアウトマウス / NMD / 神経変異マウス / DNAアレイ

Research Abstract

1、Gene Trap Microarray法による神経系遺伝子の破壊
ジーントラップ法によりマウスES細胞を標的としたランダムな変異体作製を行い、新たに多数のクローンの変異体ES細胞クローンを単離、凍結した。3'RACE法によりトラップベクターのゲノム上の挿入部位を決定した結果、神経組織で特異的に発現する遺伝子が多数破壊されていることが確認された。また、変異体クローン中で破壊されている未知遺伝子をプローブとして載せたDNAアレイを作製し、発現解析が行われた。
2、ジーントラップ法の改良
本研究で用いられている新しいジーントラップ法(UPATrap法)では、mRNA上に存在するIRES(internal ribosome entry site)がNMD(Nonsense mediated mRNA decay)を抑制するという原理が応用されている。これにより、標的細胞における遺伝子発現の有無に関わらず遺伝子を破壊することに成功している。しかし、その一方で作製された変異マウスにおいて、IRESの働きにより異常はタンパク質が合成されるという欠点が存在することが明らかになった。NMDの抑制機構について解析した結果、mRNA上の二次構造がNMD抑制に重要であることが判明し、ジーントラップベクター内に使用されているIRESを他の二次構造を形成する配列で代用可能であることを明らかにした。この改良型ベクターを用いることにより、効率的な遺伝子破壊が可能であることが示された。
この研究成果については、第20回国際生化学・分子生物学会議(京都2006)においてポスター発表を行っている。