高品質結晶によるアミノ基転移酵素の反応中間体の高分解能構造解析

Research Project

Project/Area Number	06235214
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
Allocation Type	Single-year Grants
Research Institution	Osaka City University
Principal Investigator	広津建大阪市立大学, 理学部, 教授 (10047269)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	林秀行大阪医科大学, 医学部, 助教授 (00183913)
Project Period (FY)	1994 – 1995
Project Status	Completed (Fiscal Year 1994)
Budget Amount *help	¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000) Fiscal Year 1994: ¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000)
Keywords	アミノ基転移酵素 / ラウエ法 / 反応機構 / 変異型酵素 / 時間分割構造変化 / コンホメーション変化
Research Abstract	アスパラギン酸アミノ基転移酵素(AspAT)は同じサブユニット2個からなる2量体である。サブユニットは大小2つのドメインからなり、基質結合時に小ドメインがコンホメーション変化を伴って、大きく動き活性部位を閉じる。これはopen⇔closed変化と呼ばれるもので、大腸菌から高等動物に至るまで、これまで高次構造の決定されたすべてのAspATにおいて見られる現象である。またこの変化が触媒反応にとって極めて重要である。我々の研究している大腸菌AspATは結晶状態を維持したままこの変化(反応)を起こすことがわかり、ラウエ法による触媒反応の動的解析の可能性が示された。AspATの触媒反応の動的X線構造解析を行うには、反応の各段階を基質類似体を用いてトラップし、それらの高次構造を明らかにしておくことが重要である。これまでPLP型AspATの高次構造を明らかにしてきたが、今回はPMP型AspATおよびPMP型AspATと基質阻害剤との複合体(2個)の高次構造を決定した。その結果に基づいて、PMP型AspATからPLP型AspATへ向かう数ステップの反応機構を提案した。特に重要な点は、基質類似体であるglutarateがopen型AspATに結合していたことである。分光学的研究より、AspATと基質類似体との複合体はopen型とclosed型との間の平衡にあることが推定されていたが、今回直接このことが証明された。基質はopen型AspATの活性部位に結合し、続いてclosed型への変化により、溶媒領域から隔離され疎水環境に置かれるのである。これまで、一部の変異型AspATの結晶しか良質のラウエ回折パターンを与えなかった。酵素の精製法と結晶化法を改良し、野生型およびいくつかの変異型AspATについて、動的解析が可能な結晶の作製に成功した。今後、反応の遅い基質類似物を利用して、フローセルによる動的解析を行う予定である。