NMDAレセプターの大量生産とその三次元構造解析

• Project/Area Number: 06253205
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 山根 和彦 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 助手 (70192797)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 豊島 近 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 教授 (70172210)
• Project Period (FY): 1994
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1994)
• Budget Amount: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000); Fiscal Year 1994: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000)
• Keywords: バキュロウイルス / NMDAレセプター / 大量生産 / メタノール資化性菌 / 翻訳開始部位 / 転移ベクター / 融合遺伝子 / 発現プロモーター

Research Abstract

1 バキュロウイルス発現系によるレセプターの大量生産の試み
まず、NMDAレセプター遺伝子を転移ベクターpBlueBacHisに組み込んだ。選別したウイルスを非感染細胞Sf9に感染させ、経時的に(2-10日)産生したタンパク質を電気泳動したところ、目的の105kDa以上のところにクマシ-染色される特異的なバンドは観察されなかった。
2 大量発現のためのベクターの検証
すでに大腸菌で大量生産がうまくいっている蛋白質であるP糖蛋白質C末端部分の生産を指標に発現量をみたところ、pBlueBacHisをもちいると大腸菌での発現の約1/1000ときわめて発現量が低いことがわかった。発現プロモータが強力なポリヘドリンプロモータであっても、翻訳開始部位の構造の違いによって発現量が低下することが指摘されており、本ベクターはそのために発現量が低下している可能性が高い。
以上の結果より、翻訳開始部位が大量発現に適した構造の遺伝子の下流に目的の遺伝子を融合させるかたちで発現させるのが有効であると考えた。研究の過程で、P糖蛋白質C末端部分中のメチオニンを翻訳開始メチオニンとした場合にP糖蛋白質C末端部分の高発現がみられたので、P糖蛋白質C末端部分中のメチオニンを翻訳開始メチオニンとした転移ベクターを作製した。これを用いて発現を試みている。
3 他の大量発現系の利用
別の大量発現系であるメタノール資化菌(1ミリリットルの培養液につき数ミリグラムの生産が多数報告されている)によるNMDAレセプターの発現を試みている。