ショウジョウバエ中枢神経系培養細胞株を用いた細胞増殖阻害因子の研究

Research Project

Project/Area Number	06256217
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
Allocation Type	Single-year Grants
Research Institution	Nippon Medical School
Principal Investigator	程久美子 (宇井久美子) 日本医科大学, 医学部, 講師 (50213327)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	松田恒平日本医科大学, 医学部, 助手 (60222303) 益田佳織日本医科大学, 医学部, 助手 (60202313) 宮田雄平日本医科大学, 医学部, 教授 (00014275)
Project Period (FY)	1994
Project Status	Completed (Fiscal Year 1994)
Budget Amount *help	¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000) Fiscal Year 1994: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
Keywords	Drosophila / 中枢神経系 / 培養細胞株 / Apoptosis / DNA fragmentation / Ca^<2+> / 細胞内情報伝達系 / 細胞生物学
Research Abstract	ショウジョウバエにおけるプログラムされた細胞死は、発生の早い時期を除けば、主に中枢神経系でおこることが報告されている。私たちは、ショウジョウバエ中枢神経系より培養細胞株を樹立し、クローン細胞株を得た。これらの細胞株の中には、昆虫の神経特異的マーカーとして知られている抗HRP抗体反応性を示し、神経伝達物質と考えられるアセチルコリン、L-dopa、ペプチド、アミノ酸、等を含むものがあることを示した。そこで、これらの細胞をモデル神経細胞として用い、ショウジョウバエにおいてもアポトーシスが起こるか否かを検討した。アポトーシスは、現在のところ、電子顕微鏡観察によるクロマチンの凝集などの形態学的変化と、ヌクレオソーム単位でのDNAの断片化という生化学的特徴によって定義されている。ショウジョウバエ中枢神経系由来クローン細胞株、ML-DmBG2-c2,を用いて、哺乳類細胞においてアポトーシスを誘導することが示されている種々の薬物に対する反応を検討した結果、Ca^<++>イオノフォア(A23187),PKC inhibitor(H-7),Poly(ADP-ribose)polymerase inhibitor(nicotinamide)などを加えることによってDNAのラダーがみられ、哺乳類でのアポトーシスの場合と同様に180-200bp単位でDNAの断片化が起こることがわかった。DNAのラダーの大きさから、おそらく、この断片化はヌクレオソーム単位で起こっていると考えられる。この際、DNAの断片化を伴って死に至る細胞は、発生中の胚でおこる細胞死と同様にAOで染色された。また、電子顕微鏡観察によりクロマチンの凝集も起きているものがあることがわかった。これらの結果から、ショウジョウバエにおいてもDNAの断片化とクロマチンの凝集を伴うアポトーシスが起こると結論された。また、哺乳類の細胞でのアポトーシスには、RNA合成阻害剤(actinomycin-D(AMD)),タンパク合成阻害剤(cycloheximide(CHX))によって抑制されるものがあることが報告されているが、AMD,CHXは、単独でDNAの断片化を誘導することがわかった。今回用いたすべての薬物によるDNAの断片化は、Ca^<++>キレーター(BAPTA)によって抑制された。このことは、アポトーシスの過程のどこかにCa^<++>が関与していることを示している。細胞外液中のCa^<++>を除いた際には、A23187以外の薬物によるDNAの断片化はすべて起こったが、A23187による断片化は抑制された。このことから、A23187は細胞外のCa^<++>を細胞内に流入させることによって断片化を誘導していると考えられる。細胞質内のCa^<++>濃度は、通常低く保たれているはずであるので、A23187以外の薬物によるアポトーシスには、細胞内のどこかに貯蔵されているCa^<++>が必要であると考えられる。 Ca^<++>-dependent endonuclease阻害剤であるaurintricarboxyric acid (ATA)を用いると、A23187によるDNAの断片化は阻害されたが、H-7,nicotinamide,AMD,CHXによる断片化は阻害されなかった。また、一般的にendonucleaseはZn^<++>により阻害されるが、A23187による断片化は50μMのZn^<++>によって阻害され、H-7,nicotinamide,AMD,CHXによる断片化は5mMのZn^<++>で阻害され、断片化を阻害するZn^<++>の濃度が異なることがわかった。従って、用いた薬物によってDNAを断片化するendonucleaseは、少なくとも2種類あると考えられる。