修飾オリゴヌクレオチドを用いた紫外線損傷DNA修復機構の解析

• Project/Area Number: 06263201
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 森岡 弘志 北海道大学, 薬学部, 助手 (20230097)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岩井 成憲 北海道大学, 薬学部, 助手 (10168544) ; 井上 英夫 北海道大学, 薬学部, 助教授 (80088856) ; 大塚 栄子 北海道大学, 薬学部, 教授 (80028836)
• Project Period (FY): 1994
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1994)
• Budget Amount: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000); Fiscal Year 1994: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
• Keywords: 紫外線損傷DNA / チミンダイマー / T4エンドヌクレアーゼV / メチルホスホネート / オリゴヌクレオチド

Research Abstract

以下に、今年度得られた新たな知見等の成果を示す。
(1)チミンダイマーのヌクレオシド間のリン酸残基をメチルホスホネートに修飾したオリゴヌクレオチド(d(GCACGT[pMe]TGCACG、T[pMe]T:メチルホスホネート結合を有するチミンダイマー誘導体)を化学合成し、高速液体クロマトグラフィーで分離精製した。なお、合成の際に生じるチミンダイマー間のリン酸結合の2種類のジアステレオマ-(Rpメチルホスホネート体およびSpメチルホスホネート体)をそれぞれ分離同定した。相補鎖とハイブリダイズさせて2本鎖とした後、合成遺伝子を大腸菌内で発現させ精製されたT4エンドヌクレアーゼVを用いて、フィルターバインディング法により酵素-基質複合体の解離定数を求めた。その結果、通常のチミンダイマーを含む基質を用いた場合には2.0×10^<-8>M、Spメチルホスホネート体では1.6×10^<-7>M、Rpメチルホスホネート体では結合がみられなかった。また、酵素による基質の切断反応を調べたところ、Spメチルホスホネート体では切断が見られたのに対して、Rpメチルホスホネート体では切断はみられなかった。すなわち、(i)チミンダイマー部分のリン酸基に存在する酵素原子が酵素と相互作用していること、(ii)T4エンドヌクレアーゼVは基質DNA中のチミンダイマー部位に対してマイナ-グルーブ側から結合していることが明らかにされた。この解析結果は、既に得られているメチル化保護法の結果と一致した。
(2)(6-4)光産物を含むオリゴヌクレオチド(d(CAAT[6-4]TAAG)、T[6-4]T:(6-4)光産物)を合成した。さらに、T4DNAリガーゼにより結合させ、鎖長28および57の2本鎖DNAを作製した。また、チミンダイマー、(6-4)光産物等のDNA損傷を特異的に認識する数種のモノクローナル抗体の可変領域部のcDNAをクローニングした。