| Project/Area Number |
06267210
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Aichi University of Education |
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Principal Investigator |
羽渕 脩躬 愛知教育大学, 教育学部, 教授 (90024067)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
福田 雅一 愛知教育大学, 教育学部, 助教授 (70242899)
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| Project Period (FY) |
1994
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1994)
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| Budget Amount *help |
¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,300,000)
Fiscal Year 1994: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,300,000)
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| Keywords | 硫酸転移酵素 / コンドロイチン硫酸 / プロテオグリカン / クローニング / 軟骨細胞 |
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| Research Abstract |
1.コンドロイチン6硫酸転移酵素の精製、cDNAクローニング
培養ニワトリ軟骨細胞の無血清培養液から、コンドロイチンのGalNAcの6位に硫酸基を転移するコンドロイチン6硫酸転移酵素(C6ST)を均一に精製した。精製酵母、及びV8プロテアーゼによる限定分解で得られるペプチドのアミノ末端アミノ酸配列を決定した。アミノ酸配列に基づき、縮重オリゴヌクレオチドを合成し、RT-PCR法によりDNA断片を増幅した。このDNA断片の塩基配列を決定し、これをプローブとして、軟骨細胞poly(A)+RNAから作製したcDNAライブラリーをスクリーニングし、cDNAをクローニングした。ORFから推定されるタンパク質は、アミノ酸458残基を含み、N結合糖鎖結合部位を6個含むII型膜蛋白であった。このcDNAによりコードされる蛋白がC6STであることは、(1)動物細胞の発現ベクターにcDNAを組み込み、COS-7細胞で発現させたとき、C6ST活性が対照の20倍以上となること、(2)cDNAの一部を大腸菌の発現ベクターに組み込み、大腸菌で発現された融合蛋白に対する抗体を作製したところ、こん抗体はC6STと結合することから確認された。
2.コンドロイチン6硫酸転移酵素の基質特異性
放射性硫酸を取り込んだケラタン硫酸の脱アセチル化/亜硝酸分解産物の分析により、精製されたC6STはコンドロイチンのGalNAc残基の6位だけでなく、ケラタン硫酸のGal残基の6位にも硫酸基を転移することを示した。
3.ヘパラン硫酸6硫酸転移酵素の精製
CHO細胞の無血清培養液から、ヘパラン硫酸6硫酸転移酵素を均一に精製した。この酵素は、GlcNSの6位に硫酸基を転移するが、GlcNのアミノ基、IdoAの2位には転移しなかった。
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