| Project/Area Number |
06282263
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Kurume University |
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Principal Investigator |
山田 亮 久留米大学, 医学部, 助手 (50158177)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
七條 茂樹 久留米大学, 医学部, 講師 (30080592)
星野 友昭 久留米大学, 医学部, 助手 (00261066)
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| Project Period (FY) |
1994
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1994)
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| Budget Amount *help |
¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
Fiscal Year 1994: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
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| Keywords | 接着分子 / 癌 / 早期診断 / 遺伝子同定 |
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| Research Abstract |
1.タンパクレベルでの解析:抗LFA-1抗体(2F12)をもちいて胃癌細胞株MKN45.16より免疫沈降を行ない、SDS-PAGEによる解析を行なった。その結果、約200KDのブロードな分子量からなる単量体であり、N-結合型糖鎖を有する糖タンパクである事が明らかとなった。白血球LFA-1と異なり、インテグリンβ2鎖のassociationは認められず、2次元電気泳動では等電点6.0のシングルスポットとして検出された。
2.遺伝子解析:LFA-1特異的プライマーとRT-PCR法を用いたメッセージレベルの解析で、MKN45.16細胞ではLFA-1遺伝子が発現していない事が示され、ノーザンブロッティングでも確認された。また、low stringency下でハイブリダイゼーションを行なったところ、LFA-1メッセージよりも僅かに大きなサイズ(5.5-6Kb)のメッセージが確認された。これらのことより、LFA-1様抗原をコードする遺伝子はLFA-1遺伝子とは異なるが、ある程度ホモロジーがある事が示唆された。
3.LFA-1様抗原遺伝子のクローニング:MKN45.16細胞より真核細胞発現ベクターpME18Sを用いてcDNAライブラリーを作製しCOS-7細胞に発現させた。Seedらの方法の変法によりLFA-1様抗原遺伝子の濃縮・単離を行ない、最終的に2個のcDNAクローンが得られた。これらについて塩基配列の決定を行なったが、いずれのクローンも終始コドンにより分断されており、LFA-1様抗原をコードしえないことが示唆された。また、本法ではバックグランドが高いためクローンの濃縮効率が悪く、LFA-1様抗原遺伝子のクローニングには適さない事も判明した。そこで、LFA-1様抗原を精製し、部分ペプチドのアミノ酸配列の決定およびそれにもとずきクローニングを行なう事とし、現在、それらに着手しているところである。
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