| Project/Area Number |
06660348
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| Research Category |
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Applied animal science
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| Research Institution | Ibaraki University |
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Principal Investigator |
高坂 哲也 茨城大学, 農学部, 助教授 (10186611)
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| Project Period (FY) |
1994
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1994)
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| Budget Amount *help |
¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000)
Fiscal Year 1994: ¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000)
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| Keywords | リラキシン / 発現プラスミドの構築 / 組換え遺伝子の発現 / 組換え体の単離 / 大腸菌による大量発現 / 精子への影響 / 雄豚 / 精のう腺 |
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| Research Abstract |
本研究では、豚の精嚢腺で発見したリラキシン(RXN)様物質の大腸菌での発現系の確立とその組換え体を用いた生理機能解明への応用を計画し、以下の成果を得た。
I.豚精嚢腺RXN様物質の大腸菌での発現系の確立
申請者らは、豚精嚢腺RXN様物質のcDNAのクローニングに成功したことから、それを基に、遺伝子増幅装置により翻訳領域をコードするcDNA断片を増幅させ、クローン化させた。変異が起きていないことを配列分析で確認した後、これを導入遺伝子として、発現ベクターpGEXに組込み、大腸菌に形質転換させた。本研究で構築した発現プラスミドは、IPTG誘導下で、RXN様物質をグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)との融合蛋白として大腸菌内に産生させ、菌体全蛋白の約10%を占める高レベル発現系を実現化させるものであった。尚、融合蛋白は、アフィニティーカラムで菌体抽出液から簡単に精製でき、トロンビン処理により目的蛋白を容易に純化できた。
II.大腸菌で発現させた豚精嚢腺RXN様物質の機能解明:特に精子に対する作用性の解析
豚精巣上体尾部精子を用い、大腸菌で発現させた組換え体豚精嚢腺RXN様物質の精子に対する作用を解析した。その結果、RXN様物質には豚精子の運動能を活発化させる作用のあることが判明した。また、本組替え体蛋白に非放射性標識物質Eu(ユーロピウム)を標識し、豚精子に対する組換え体豚精嚢腺RXN様物質の結合能を調べた結果、明らかに精子に結合していることがわかり、精子に対するRXN様物質の作用がリセプターを介して発現されていることが判明した。
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