哺乳類配偶子における同種認識と付着に関与する物質の細胞化学的研究

Research Project

Project/Area Number	06670007
Research Category	Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	General anatomy (including Histology/Embryology)
Research Institution	Chiba University
Principal Investigator	豊田二美枝千葉大学, 医学部, 助教授 (60009751)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	前川眞見子千葉大学, 医学部, 助手 (20181571) 永野俊雄千葉大学, 医学部, 教授 (60009082)
Project Period (FY)	1994
Project Status	Completed (Fiscal Year 1994)
Budget Amount *help	¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000) Fiscal Year 1994: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
Keywords	マウス精子 / 透明帯リセプター / 凍結割断法 / 共焦点レーザー顕微鏡 / 金コロイド標識表面レプリカ法 / 細胞組織化学
Research Abstract	マウス卵に透明帯を構成する糖蛋白質の一つZP3と特異的に結合するマウス精子のもつ蛋白質SP56(Mr 56,000)は最有力の透明帯リセプター(Rzp)である。我々はDr Bleil等と共同でSP56がRzpである、同種卵の認識と結合に関与するために必要な位置に局在するか否かを調べた。マウス精子の頭部は特有な釣り針状をしているが、モノクローナル抗体によるSP56の局在を先ず共焦点顕微鏡で観察した所、先体部の辺縁に三ケ月状に分布し、既報のZP3の結合位置と一致することがわかった。又これは受精のさいにマウス精子が透明帯に付着する位置ともよく一致する。更に我々は免疫-金コロイド法と表面レプリカ法を組み合わせて、細胞膜表面にあある抗原物質の局在を細胞全景の中で電子顕微鏡レベルでとらえる方法を開発した。免疫反応により細胞膜表面に付着した金粒子はPt-C蒸着時にトラップされて、精子が溶解された後もレプリカ膜に残留し、抗原の位置を示しうる。方法はマウス精巣上体精子をTYH溶液中で1時間培養した後、1%パラフォルムアルデヒド溶液で固定し、洗浄後、APES処理したスライドグラスに付着させた。ブロッキング後、上記一次抗体で処理し、金粒子標識二次抗体を作用させ、グルタールアルデヒドで再固定後、エタノール系列で脱水、酢酸イソアミルを中間液として臨界点乾燥し、ガラス上の精子のPt-Cレプリカを作成した。ハイタ-原液でレプリカ膜をガラス面から剥がし、精子を溶解、水洗後グリッドに掬い、透過電顕で検鏡した。表面レプリカ法による観察では後輪(頭部と頸部の境界線)や先体の後端、辺縁部などが明瞭に識別できる。本法によりSP56は精子頭部最尖端部には存在せず、上記先体辺縁部を被う細胞膜外表面に局在する事が確認され、Rzpとしての条件を満たすことが確認された。又精子尾部の捩れの様子が全長にわたって観察できるので、運動の状態と尾部の捩れとの関連を調べる手段となりうる。