ウェルシュ菌のθ-毒素産生機構の分子遺伝学的解析

Research Project

Project/Area Number	06670293
Research Category	Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Bacteriology (including Mycology)
Research Institution	Osaka University
Principal Investigator	東雍大阪大学, 医学部, 教授 (60028371)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	今川忠大阪大学, 医学部, 講師 (10036478) 土肥義胤大阪大学, 医学部, 助教授 (10028574)
Project Period (FY)	1994
Project Status	Completed (Fiscal Year 1994)
Budget Amount *help	¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000) Fiscal Year 1994: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
Keywords	C.perfringens / Substance A / Expression of θ-Toxin / Molecular cloning
Research Abstract	我々はウェルシュ菌には生理的条件下に極めて不安定な低分子量物質(a-物質)が一つの中心的な役割を果たすレギュロン様の病原因子産生調節機構が存在することを明らかにしてきた。これらの病原因子のうち、検出感度の最も高いθ-毒素の発現系を利用したa-物質のアッセイ系を考案して、a-物質の産生を調べてみると野生株は菌体外にもa-物質を放出(分泌)していることが明らかになった。また、a-物質の仮想産生系遺伝子をクローン化する試みとして、我々はまず、親株(PB6K株)からa-物質を産生するθ-毒素非産生突然変異株とa-物質を産生しないθ-毒素非産生突然変異株を分離した。両者を混合培養したり、前者の培養濾液を後者の生菌に加えるとθ-毒素を産生する。次に、前者の染色体DNAを適当な大きさの断片にして大腸菌〜ウェルシュ菌間のシャトルベクターにつなぎ、種々の条件で後者に導入する事を試みたが結局導入は成功しなかった。これはPB6K株に制限修飾系が存在しているためと考えられたので、オーストラリアのJ.I.Roodから制限修飾系の欠損したとみられる導入効率の極めて高いウェルシュ菌Strain 13ならびに彼らが作製したシャトルベクター,pJIR418を、農林水産大臣への申請という煩雑な手続きを経て6ヶ月後にようやく入手した。早速、Strain 13をニトロソグアニジン処理してa-物質を産生しないθ-毒素非産生株,♯12-9を分離した。現在、PB6K株由来のa-物質を産生するθ-毒素非産生株,a32株の染色体DNA断片をpJIR418ならびに我々が新たに構築したコンパクトなシャトルベクター,pT14(未発表)につないだハイブリドプラスミドを♯12-9株に導入してθ-毒素産生株を検索している。3〜5000個のコロニーを検索する予定で、現在までの所、まだθ-毒素産生株はクローン化できていない。