| Project/Area Number |
06671073
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| Research Category |
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Hematology
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
東絛 有伸 東京大学, 医科学研究所, 助手 (00211681)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小澤 敬也 東京大学, 医学科学研究所, 助教授 (30137707)
浅野 茂隆 東京大学, 医学科学研究所, 教授 (50134614)
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| Project Period (FY) |
1994
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1994)
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| Budget Amount *help |
¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
Fiscal Year 1994: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
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| Keywords | G-CSF / トキシン / 骨髄性白血病 / タ-グティング療法 |
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| Research Abstract |
米国NIHのI.Pastan博士から供与されたプラスミドpVC38HはヒトTGF-αと細胞膜結合領域を欠失した緑膿菌外毒素(PE40)からなるキメラ毒素の大腸菌発現ベクターである。このベクターのTGF-α領域を制限酵素で切り出し、シグナルペプチドを除いたヒトG-CSFの塩基配列を挿入した。このプラスミドpTG401で大腸菌BL21(IDE3)株の形質転換を行い、得られた複数のクローンをIPTG添加で培養してキメラ毒素の発現量の高いものを保存した。
そのひとつのクローンを大量培養し、IPTGで誘導をかけて毒素の産生を促した後、回収した菌体を浸透圧ショックで破砕した。得られた可溶性分画からイオン交換クロマトグラフィーならびにFPLCを用いてキメラ毒素G-CSF-PE40を精製した。このキメラ毒素の生物活性をG-CSF依存性に増殖可能なマウス骨髄性白血病細胞株NFS-60を用いて検討した。
[1]G-CSF-PE40は用量依存性にNFS-60細胞の蛋白質合成を阻害し、また殺細胞効果を示した。そのLD50は約5ng/mlであり、PEそのものの約1/10の値であった。
[2]NFS-60細胞をG-CSFの非存在下にG-CSF-PE40と約16時間接触させた時点で^3H-チミジンの取り込みを測定すると、用量依存性のDNA合成刺激効果が見られた。
[3]G-CSF-PE40はマウスproB細胞株であるBa/F3の増殖には影響しなかった。
[4]G-CSF-PE40は^<125>I-G-CSFのヒト好中球への特異的結合を用量依存的に抑制した。
以上の結果からわれわれの作製したキメラ毒素G-CSF-PE40は骨髄系細胞特異的に期待通りの殺細胞効果を示した。
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