トロンビンレセプター活性化放出ペプチドのラジオイムノアッセイの開発と臨床応用

• Project/Area Number: 06671098
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Hematology
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 東 博之 徳島大学, 医学部・附属病院, 助手 (10241275)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 新谷 保実 徳島大学, 医学部・附属病院, 助手 (10235773)
• Project Period (FY): 1994
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1994)
• Budget Amount: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000); Fiscal Year 1994: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
• Keywords: トロンビンレセプター / トロンビン / ラジオイムノアッセイ / 合成ペプチド / DIC / 下肢静脈血栓症 / 心筋梗塞

Research Abstract

1991年Coughlinらによってクローニングされたトロンビンレセプター(TR)は、425アミノ酸残基からなるG蛋白質共役型レセプターである。トロンビン1分子とTR1分子が結合すると、TRのN末端15アミノ酸残基からなるトロンビンレセプター活性化放出ペプチド(トロンビンレセプター(1-15):TR(1-15)が遊離されTRが活性化される。我々はこのTR(1-15)のラジオイムノアッセイ(RIA)の開発を試みた。
(1)抗体はTR(1-15)をヒトサイログロブリンとconjugateしたものを免疫原として、家兎に免疫して作製した。
(2)トレーサーはTyr-TR(1-15)を酵素法でヨード化した後、ゲル濾過法で純化した。
(3)アッセイは競合法によるRIAで行い、トレーサーを遅延添加した後、BF分離を2抗体法で行った。
このRIAシステムを用いて、正常人の血漿TR(1-15)濃度の直接測定を行った。また、Sep-pak C18による血漿からの抽出法も検討した。
RIAの最小検出感度は0.08ng/mlであった。アッセイ内CV値は3.8%で、アッセイ間CV値は6.7〜10%であった。血漿の直接測定では血漿成分の非特異的影響が認められたため、Sep-pak C18による方法で血漿TR(1-15)の抽出操作について検討した。その結果、緩衝液に合成TR(1-15)を添加した回収試験における回収率は86.7%〜104.0%(平均94.35%)であり、血漿に合成TR(1-15)を添加した場合の回収率は75.6〜97.3%(平均86.95%)であった。本抽出法による回収は良好で、血漿成分による非特異的影響も低下しており正常血漿中TR(1-15)の抽出に有用であると思われた。しかし、正常血漿中TR(1-15)濃度の測定では、抽出操作により5倍の濃縮操作を行ったにも関わらず最小検出感度以下であった。
現在、(1)サンプル調整用のための抽出操作で抽出液の種類および濃度について検討し、血漿成分による非特異的影響をさらに低下させる、(2)この測定系を用いて、DIC、下肢静脈血栓症、心筋梗塞などの血液凝固能が亢進する病態について血漿中TR(1-15)を測定し、これらの状態で測定可能濃度となるか、(3)アッセイ感度を上げるために第一抗体として現在使用している家兎ポリクローナル抗体以外に新たにモノクローナル抗体を組み合わせたEIA法の開発を行っている。

Research Products

• [Publications] 宮本 和正 他: "トロンビンレセプター(1-15)のラジオイムノアッセイに関する基礎的検討" 日本血液学会雑誌(抄録). (in press).