| Project/Area Number |
06680575
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| Research Category |
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Structural biochemistry
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
室伏 擴 東京大学, 大学院・理学系研究科, 助教授 (70101128)
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| Project Period (FY) |
1994
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1994)
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| Budget Amount *help |
¥2,300,000 (Direct Cost: ¥2,300,000)
Fiscal Year 1994: ¥2,300,000 (Direct Cost: ¥2,300,000)
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| Keywords | Xenopus卵 / DNA複製 / DNA複製開始因子 / DNAヘリカーゼ / DNA untwisting因子 / HMGボックス / 腹水肝がん細胞 / DNA依存プロテインキナーゼ |
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| Research Abstract |
1.Xenopus卵のDUF(DNA untwisting/unwinding factor)の小サブユニット(96kDa)に対するモノクローン抗体を調整した。この抗体を用いた新しいXenopus DUFの精製法を確立した。
2.DUFの小サブユニットに対する抗体を用いて、Xenopusの培養細胞A6を染色した。その結果、DUFは主として核に存在することがわかった。
3.Xenopus卵抽出液に、除膜した精子頭部を添加すると、卵抽出液中のDUFは精子核と結合して、形成された核構造体中に取り込まれることがわかった。
4.環状一本鎖DNAにオリゴヌクレオチドをアニールさせた基質を調整し、DUFの持つDNAヘリカーゼの性質を調べ、以下の結果を得た。オリゴヌクレオチドの3′端に一本鎖部分を持つ基質に対するヘリカーゼの活性は高かったが、5′端に一本鎖部分を持つ基質、および一本鎖部分を持たない基質に対する活性は低いことがわかった。このことから、DUFのDNAヘリカーゼの方向性はSV40のT-抗原の持つヘリカーゼとは逆に、5′端から3′端方向であることがわかった。DUFのDNAヘリカーゼはATPあるいはdATP存在下で活性を示し、他のNTPおよびdNTP存在下での活性は低かった。
5.Xenopus DUFはcdc2/cyclinBおよびDNA依存プロテインキナーゼによってリン酸化され、特に、後者によってDNAヘリカーゼ活性が亢進することがわかった。
6.Xenopus DUFの小サブユニットのcDNAクローニングを行い(現在進行中)、このサブユニットがHMGボックスを持つタンパク質であることを見いだした。
7.DUFの小サブユニットに対する抗体を用いて、ラット腹水肝がんAH7974細胞からDUF類似タンパク質を精製した。その結果、AH7974細胞のDUF小サブユニット類似タンパク質はXenopusのものよりも小さい分子量(55kDa)を持ち、他の11種類のタンパク質と安定な複合体を形成していることがわかった。
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