神経細胞死とカルモデュリン依存性細胞骨格蛋白質燐酸化反応の分子細胞生物学的研究

Research Project

Project/Area Number	06680762
Research Category	Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Neurochemistry/Neuropharmacology
Research Institution	Kumamoto University
Principal Investigator	山本秀幸熊本大学, 医学部, 講師 (60191433)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	福永浩司熊本大学, 医学部, 助教授 (90136721)
Project Period (FY)	1994
Project Status	Completed (Fiscal Year 1994)
Budget Amount *help	¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000) Fiscal Year 1994: ¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000)
Keywords	カルシウム / カルモデュリン / 蛋白質燐酸化酵素 / 微小管不随蛋白質2 / カルシニューリン / PC12細胞 / 神経細胞 / 神経細胞死
Research Abstract	平成5年度にPC12細胞を用いて、マウスCaMキナーゼIIアルファーサブユニットを大量に発現する複数の安定なクローン細胞の確立に成功した。得られたクローン細胞を用いて、以下の実験を行なった。1)CaMキナーゼIIアルファーサブユニットに対するcDNAを用いて、ノーザンブロットを施行した。クローン細胞では、CaMキナーゼIIアルファーサブユニットのmRNAの発現が確認された。野生型PC12細胞のCaMキナーゼIIのmRNAは本プローブでは検出されなかった。2)脳のCaMキナーゼIIに対する抗体を用いてイムノブロットを施行した。クローン細胞ではCaMキナーゼIIアルファーサブユニットの発現が確認された。野生型PC12細胞では抗体との反応性が弱く、PC12細胞内に、脳とは異なるアイソザイムの存在が示唆された。3)PCR法によりラットCaMキナーゼIIの4種類のサブユニットのcDNAを得た。野生型PC12細胞ではアルファーサブユニット以外の発現が確認された。4)クローン細胞では微小管付随蛋白質2(MAP2)の燐酸化反応が増強された。本反応は、細胞内カルシウム濃度を増加させる刺激により著しく促進された。5)野生型細胞では細胞内カルシウム濃度を増加させる刺激によりMAP2の燐酸化は著明に減少した。サイクロスポリンを用いた実験から、本脱燐酸化反応にはカルシニューリンが関与することが示唆された。6)細胞をdibutyryl cyclic AMPで処理した場合の神経突起伸展がクローン細胞では著明に抑制された。この抑制は酵素の発現量と相関した。以上の結果より、過剰発現されたCaMキナーゼIIがMAP2の燐酸化を増強させること、及び、神経細胞の形態変化に影響を与えることが明らかとなった。今後、本酵素の細胞死に対する影響を検討する予定である。