P1ファージ由来組換え酵素導入による条件依存性変異体マウスの作成

• Project/Area Number: 06680839
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Laboratory animal science
• Research Institution: Japanese Foundation For Cancer Research
• Principal Investigator: 美野輪 治 財団法人癌研究會, 癌研究所・細胞生物部, 研究員 (00181967)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高野 洋志 癌研究所 細胞生物部, 研究員 (00241555)
• Project Period (FY): 1994
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1994)
• Budget Amount: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000); Fiscal Year 1994: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
• Keywords: 標的組換え / LoxP / Cre酵素 / P1ファジ- / 条件依存性変異 / ES再細胞

Research Abstract

標的遺伝子組換え法は、ある特定の遺伝子の機能についてin vivoの解析を可能にする有力な方法である。一方多くの遺伝子は、生体の発生・分化の各段階において多様な役割を担っていると考えられ、従来の標的組換え法のみでは、変異体が異常をきたす段階以降については、その解析が不可能である。そこで、標的遺伝子組換え法の応用範囲を拡張し、解析可能なマウスの発生・分化の段階を拡大するために、条件依存性の標的組換え法の開発が必須である。
(1)対象遺伝子の検討 まずこの方法対象となる遺伝子の検討を行った。我々の研究室で、従来の標的組換え法により既に変異の生殖細胞系列への寄与が確認されているIP3受容体(IP3R),HGF/SF,APCの3種の遺伝子を選んだ。IP3R変異体に関しては、詳細な表現型の解析を現在続行中である。HGF/SFについては、そのホモ接合変異体が、胎生期に胎盤の形成不全のために致死である事を明らかにした。従って、これ以降の発生におけるHGFの機能を明らかにするためには、条件依存性変異体の作製が有効である。またAPC遺伝子については、そのホモ接合変異体が、発生のごく初期、即ち原腸陥入以前に既に致死である事が明らかとなり、同様に条件依存性変異の導入が必須である。
(2)APCへの応用 まず条件依存性標的組換え法をAPC遺伝子に応用するためにES細胞中での組換え酵素の発現とその効果の検討を行った。APC遺伝子の第14エクソンの上流及び下流の2ヶ所にLoxP配列が挿入した組換えベクターを作製し、これをES細胞に導入して潜在的変異を持つES細胞を得た。ES細胞の中で実際にCre酵素によるLoxP配列の組換えが起こる事を確認するためにCre酵素の発現ベクターを、この潜在的変異を持つES細胞に導入した。PCR法及びサザンブロット法により、APC遺伝子上で目的とするCre酵素による組換えが起きている事を確認した。これらの潜在的変異ES細胞とCre酵素による組換え変異ES細胞両者から、現在ブラストシスト注入法でマウスを作成している。