分裂終期のタバコ培養細胞BY-2より単離した190-kDa MAPの研究

• Project/Area Number: 06740608
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: 植物生理
• Research Institution: Kansai University
• Principal Investigator: 安原 裕紀 関西大学, 工学部, 助手 (80257906)
• Project Period (FY): 1994
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1994)
• Budget Amount: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 1994: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
• Keywords: タバコ培養細胞BY-2 / 微小管結合タンパク質(MAPs) / アミノ酸シークエンス / 架橋構造

Research Abstract

細胞周期を分裂終期に同調化したタバコ培養細胞BY-2より得たミニプロトプラストから微小管を調製し、この微小管から、300mM KCl処理によって、190-kDa MAPを含む粗抽出分画を得、これをFPLC-Mono Sカラムにより精製した。この精製した190-kDa MAPをウシの脳由来のMAPを含まない微小管と、インキュベートした後、固定、包埋し、その切片を電子顕微鏡観察したところ、微小管と微小管を架橋するおよそ10nmの構造が認められ、この構造が190-kDa MAPであると考えられた。また、190-kDa MAPは、Mono-Sカラムによる精製段階で、収率が、甚だしく減少したため、この精製190-kDa MAPを抗原とした抗体の作成は諦め、190-kDa MAPの部分的なアミノ酸配列の決定に重点を置いた。
190-kDa MAPを 含む粗抽出分画をSDS-PAGEにかけたのち、PVDF膜にブロットしCBB染色を行い、目的のバンドを切り出して、アミノ酸シークエンサーにかけたところ、十分な量の蛋白を用いたにも関わらず、PTHアミノ酸の信号が得られず、190-kDa MAPのN末はブロックされているものと判断した。そこで190-kDa MAPを移したPVDF膜をブロテアーゼで処理し分解を試みた。6種類のブロテアーゼを検討したが、いずれも良好でなかったため、CNBrによる分解を行った。分解処理したものを再びSDS-PAGEにかけ、PVDF膜にブロットし、CBB染色をしたところ、分解処理の収率は低かったが、いくつかのバンドが認められた。これを、アミノ酸シークエンサーにかけたが、ペプチドの量が不十分であったため、PTHアミノ酸の信号が弱く、その配列を決定するには至っていない。現在、十分量のペプチドを用いてアミノ酸配列を決定する努力を継続している。