PCR法を用いたDNA塩基配列比較によるキンウワバ類の類猿関係解析法の開発

• Project/Area Number: 06760046
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: 植物保護
• Research Institution: Chiba University
• Principal Investigator: 野村 昌史 千葉大学, 園芸学部, 助手 (50228368)
• Project Period (FY): 1994
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1994)
• Budget Amount: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000); Fiscal Year 1994: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
• Keywords: キンウワバ類 / DNA / PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法 / Proteinase K / プライマー / チトクロームオキシダーゼII

Research Abstract

遺伝子本体であるDNAのうち、ある特定の遺伝子をコードしている部分をPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法を用いて増幅させ、この部位の塩基配列を読みとり種間での比較からキンウワバの類猿関係を明らかにすることを目的とした。
まず研究上の基礎的な条件設定を決定することとし、成虫の脚1本を用いてProteinase KによりDNAの抽出を行った。抽出したDNAに遺伝子をコードしている部分のプライマーを反応させて増幅を行うこととなるが、当初予定したDNAのデータベースを利用する方法は利用するのにあたり設備等が必要であったため、研究討議なども参考にしてこれまでに公表されている論文から増幅させる部位を決定した。その結果ミトコンドリアDNA上にコードされている遺伝子の方が、DNAの抽出条件にあまり左右されず安定して遺伝し部位の増幅が行えるようであったため、チトクロームオキシダーゼII(COII)を選定し、蛾で報告されているこの遺伝子の両端部分のプライマーを合成し、増幅を試みた。
その結果、一般に行われているPCRの温度および試薬条件でCOIIと思われる断片長(約600塩基対)の増幅がアガロース電気泳動により確認されたが、安定して増幅されなかったため反応時の試薬などの条件の検討を行った。これによりほぼ安定した増幅が行えるようになったが、使用したプライマーに非特異的な部位の増幅に由来する断片が現れ、この存在により塩基配列の比較を行うことはできなかった。今後は目的とするCOII-DNA断片のみを増幅させる条件と検討と、増幅後速やかに塩基配列を行うことができる質の良い断片を得る条件の検討を行う予定である。