セルラーゼとキシラナーゼのキメラ酵素構築とその構造と機能の解析

• Project/Area Number: 06760071
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: 応用微生物学・応用生物化学
• Research Institution: Utsunomiya University
• Principal Investigator: 大井 俊彦 宇都宮大学, 農学部, 助手 (40223713)
• Project Period (FY): 1994
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1994)
• Budget Amount: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000); Fiscal Year 1994: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
• Keywords: セルラーゼ / キシラナーゼ / 糖質加水分解酵素 / キメラ酵素 / 構造と機能

Research Abstract

糸状菌A.aculeatus由来のセルラーゼおよび細菌B.pumilus由来のキシラナーゼは進化的にも遠いと考えられ、両酵素蛋白質間の一次構造上の相同性は低い。しかしながら、それらの立体構造はβ-サンドイッチ構造と呼ぶホールディング形式を持ち非常に高い類似性を示す。このことは、セルロース関連の不溶性糖質加水分解酵素の構造と機能を解明する上で、、必須と考えられる酵素蛋白質分子のホールディングと酵素機能の関係を理解するための非常に良い題材であると考えられる。そこで不溶性糖質加水分解酵素の構造と機能を蛋白質工学的手法により解析するため、両酵素間のキメラ酵素蛋白質を遺伝子操作技術を用いて作製し、得られたキメラ酵素の立体構造と活性発現の関係に関する基礎的知見を検討することを目的とした。
両者とも2枚のβ-シートの間にはさまれたクレフトと考えられる領域に活性部位が存在し触媒活性を直接担っていると考えられている。両酵素のα,β領域とβ,β領域を連結するヒンジ部分でそれぞれの領域が分断できる構造のため、両酵素遺伝子のこれらヒンジ部分近傍の塩基配列に部位特異的変異操作により新たに制限酵素部位を付加し、両遺伝子の各領域に相当する間を合成リンカーで連結するか、または制限酵素部位を付加する場合が不可能な場合はPCRによって増幅した各遺伝子のDAN断片を連結することで2種類のキメラ遺伝子[XCX,CXCと仮称]を構築した。それらの遺伝子構造は塩基配列から確認した。さらに大腸菌発現ベクターに挿入した両キメラ遺伝子を保持する各形質転換株の全蛋白質をSDS-PAGEで分析したところ、予想された分子量に相当する蛋白質バンドの存在が確認された。さらに、これら蛋白質は両酵素に対する抗血清と反応することがウェスタンブロッティングにより確認されたことから、両キメラ蛋白質の発現していることが確認された。