変異型酵素を用いた反応中間体の解析によるβ-ラクタマーゼの触媒機構の研究
| Project/Area Number |
06760072
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
応用微生物学・応用生物化学
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
足立 博之 東京大学, 教養学部, 助手 (00211699)
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| Project Period (FY) |
1994
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1994)
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| Budget Amount *help |
¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Fiscal Year 1994: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
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| Keywords | β-ラクタマーゼ / アシル酵素 / 触媒機構 / 蛋白質工学 / X線結晶構造解析 / ペニシリン / ドラッグ・デザイン |
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| Research Abstract |
申請者は,RTEM-1β-ラクタマーゼE166N変異体が基質であるペニシリンと安定なアシル中間体を形成することを見いだし、その立体構造をx線結晶構造解析により決定した(Nature359,700-705(1992))。その構造から重要と考えられたSer130の触媒における機能を明らかにするため、Ser130置換体を作成し解析した。Ser130側鎖の-OHはアシル中間体ではβ-ラクタム環のN原子と近接していたので、アシル化の開環反応でこのNへのproton donorと考えられた。置換によりこの機能のみが失われると酵素と基質が共有結合した正四面体中間体の蓄積が起こるはずである。まず、S130A変異体を作成して速度論解析したところ予想に反してkcatが1/25程にしか低下せず、むしろKmが約50倍に増加した。コンピュータ・グラフィクスで再検討したところ、SerをAlaに置換したことでできる隙間に水分子が侵入して触媒反応が進行する可能性が示唆された。またKmの低下は、Ser130側鎖の-OHが作る水素結合の構造安定性に対する寄与から理解できた。水分子の侵入をblockできるアミノ酸をグラフィクスで調べたところThrとAsnが候補として考えられたので、S130T、S130N変異体を作成解析した。S130Tでは、水素結合による構造安定性を保ちながら反応性が減少するはずだが、実際Kmの変化なしにkcatが約1/100に減少し予想したモデルが裏付けられた。残存活性は2級アルコールの反応性によると考えられる。この変異株では完全に反応が停止しないので、現在低温条件下、NMRを用いて正四面体中間体の検出条件を検討中である。S130Nでは活性が全く検出できなかったが、共有結合中間体の生成を調べるためペニシリン結合アッセイを行ったところ、ゆっくりとした結合が検出された。現在、結合がアシル化部位で起こっているか、および結晶化を検討中である。
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Report
(1 results)
Research Products
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