血管内皮細胞におけるプロスタサイクリン産生調節機構の解析
| Project/Area Number |
06770096
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
General medical chemistry
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| Research Institution | National Cardiovascular Center Research Institute |
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Principal Investigator |
原 俊太郎 国立循環器病センター研究所, 薬理部, 室員 (50222229)
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| Project Period (FY) |
1994
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1994)
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| Budget Amount *help |
¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 1994: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
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| Keywords | 血管内皮細胞 / プロスタサイクリン / プロスタサイクリン合成酵素 / サイトカイン |
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| Research Abstract |
精製したウシプロスタサイクリン合成酵素の部分アミノ酸配列より混合プライマーを設計し、PCR法によりウシ血管内皮細胞mRNAを鋳型として用い、まず、ウシプロスタサイクリン合成酵素cDNA断片を単離した。このcDNA断片の塩基配列をもとにプライマーを合成し、5′-RACE法および3′-RACE法によりウシプロスタサイクリン合成酵素の全長をコードするcDNAを得た。また、得られたcDNA断片をプローブに用い、PCR法およびプラークハイブリダイゼーション法によりヒトプロスタサイクリン合成酵素cDNAの単離にも成功した。得られたcDNAを発現ベクターSRαに組み込み、COS細胞にトランスフェクトしたところ、トランスフェクトした細胞ミクロソームに酵素活性が発現することが確認された。また、ジデオキシ法により得られたcDNAの塩基配列を決定し、その配列より本酵素の全アミノ酸配列を決定した。その結果、ウシ酵素、ヒト酵素ともに500個のアミノ酸よりなるタンパクであること、また、プロスタサイクリン合成酵素がチトクロームP-450の中で既知のものと異なる新しいファミリーを形成することがわかった。
さらに、得られたcDNAを用い、RNAブロット解析を行った。その結果、プロスタサイクリン合成酵素が心臓や肺をはじめとし、幅広い組織において発現していることがわかった。また、ウシやヒトの培養血管内皮細胞を腫瘍壊死因子(TNF)などの炎症性サイトカインで刺激すると、プロスタサイクリン合成酵素mRNA発現の上昇が観察された。
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Research Products
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