遺伝子操作によるウエルシュ菌α毒素の亜鉛結合部位と作用の解析

Research Project

Project/Area Number	06770211
Research Category	Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Bacteriology (including Mycology)
Research Institution	Tokushima Bunri University
Principal Investigator	永浜政博徳島文理大学, 薬学部, 助教授 (40164462)
Project Period (FY)	1994
Project Status	Completed (Fiscal Year 1994)
Budget Amount *help	¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000) Fiscal Year 1994: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
Keywords	ウエルシュ菌 / α毒素 / ホスフォリパーゼC / 部位特異変異法 / ヒスチジン / 亜鉛 / リガンド / 金属タンパク質
Research Abstract	ウエルシュ菌α毒素は、致死、壊死、溶血、ホスホリパーゼC(PLC)活性等を示す。α毒素は、分子内にZnを有する金属タンパクで、Znが活性発現に重要であることが報告された。一方、α毒素のアミノ酸配列と相同性が高いセレウス菌PLCのX線解析から、α毒素は分子内に3個のZnが存在し、それらは特定のHis残基を含むのアミノ酸残基にリガンドされていると推察された。今回、毒素分子中に存在する9個のHis残基すべてを部位特異変異法でGlyに置換した変異毒素遺伝子を作成し、枯草菌を用いて発現、精製後、α毒素と各変異毒素の活性を比較し、各His残基の役割を解析した。その結果、H68G、H126G、H136G、H148Gの変異毒素は、溶血、致死、PLC活性が著しく減少したが、46、207、212、241位のHis残基の変異毒素は活性の変化は認められず、H11Gは毒素の発現が認められなかった。このうち、α毒素とH148Gは、3mM Ca存在下で赤血球膜に結合したが、H68G、H126G、H136Gは結合せず、さらに、H148Gは本毒素の溶血活性を阻害した。α毒素、H68G、H126G、H136Gは分子内に2個のZnを有していたが、H148Gは1個であった。一方、^<65>Znはα毒素とH148Gに結合したが、H68G、H126G、H136Gには結合しなかった。以上の結果から、α毒素の68、126、136、148位のHis残基は毒素活性発現に重要なZnのリガンドであると考えられる。このうち、68、126、136位のHis残基は、はずれやすい3番目の金属イオンのリガンドで、毒素の結合に重要であると考えられ、148位のHis残基の結合には関与せず、作用発現に重要な2番目のZnの強力なリガンドであると思われる。一方、H11Gは発現しないことから、11位のHis残基は、毒素の構造維持に重要な1番目のZnのリガンドと推察される。