HIV vif遺伝子の作用する細胞内因子の同定

• Project/Area Number: 06770227
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Virology
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 深澤 昌史 長崎大学, 熱帯医学研究所, 助手 (20238439)
• Project Period (FY): 1994
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1994)
• Budget Amount: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 1994: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
• Keywords: HIV / vif protein

Research Abstract

HIV-1 vif遺伝子の細胞内における機能を探索する目的で、vif遺伝子産物の精製を行った。vif遺伝子産物はグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)もしくはマルトース結合タンパクとの融合タンパク質として発現、調製した。融合タンパクの発現量は極めて低いものであったが、アフィニティカラムによる精製では比較的高純度の産物が得られた。融合タンパクを培養細胞中に添加することによるシクロスポリンA(CsA)様の免疫抑制作用(IL-2産生に対する影響等)は特にみられなかった。したがってvif遺伝子との細胞内結合因子をCyP以外に求め、これを同定するための実験を以下の様に行った。
vif依存性にHIV-1の感染性粒子を産生するH9株よりmRNAを採取し、cDNAを作成した。H9株由来のcDNAはλgt11又はpGAD424を用いた発現cDNAライブラリの材料とし、前者を、^<32>PでラベルしたGST-vifによるファー・ウエスタン・ブロット、後者を、下流にvifを融合させたGAL4結合因子発現ベクターを用いた酵母菌によるtwo-hybridシステムによりスクリーニングを行った。
その結合、ファー・ウエスタン・ブロットでは極めて高いバックグラウンドが、またtwo-hybridシステムでは、vifとGAL4活性化因子との非特異的な結合がみられ、両者共にvif結合細胞因子を特定することはできなかった。しかしこのことは、vifタンパクが多種の細胞内因子に結合し得ることを示唆しており、vifタンパク自身の宿主細胞への影響は無視できぬものと考えられた。そこで、vif非依存性に感染性粒子を産生するM8166細胞由来mRNAを、H9細胞由来のcDNAによりサブトラクションを行い、vifの役割を補足する因子を同定することを目的として、発現cDNAライブラリを作製した。このcDNAライブラリをH9細胞にトランスフェクトすることにより、H9細胞がvif非依存的に感染性粒子を産生する性質を持つことを指標にvif補足因子を同定しようと試みているが、当該研究期間内では未だその様な因子を同定するには至っていない。