PCR-RFLP法による恙虫病リケッチアのDNA型別と病原性の関連

• Project/Area Number: 06770340
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: 内科学一般
• Research Institution: 宮崎医科大学
• Principal Investigator: 村井 幸一 宮崎医科大学, 医学部, 助手 (90239476)
• Project Period (FY): 1994
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1994)
• Budget Amount: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000); Fiscal Year 1994: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
• Keywords: Rickettsia tsutsugamushi / DNA型別 / Polymerase chain reaction / RFLP

Research Abstract

[目的]PCR法とrestriction fragment length polymorphysm(RFLP)法を組み合わせることによりR.tsutsugamushiのDNA型別を行い、病原性との関連を検討する。
[材料と方法]BS-C-1細胞で継代培養したR.tsutsugamushiの標準3株(Gilliam、Karp、Kato)および入江、平野株。患者末梢血は1990〜1994年度に宮崎地方で発生した恙虫病患者17例よりヘパリン採血し単核球を分離した。培養株および分離した単核球より常法にてDNAを抽出しnested法にてPCRを行った。産物をHhaIなど10種類の制限酵素で処理し、アガロースゲル電気泳動し、そのパターンによってDNA型別に分類した。
[結果]
1)RFLP法によるR.tsutsugamushiの型別:標準3株および入江、平野株を増幅し産物をHhaI処理した場合、泳動パターンにより各株の鑑別が可能であった。
2)患者末梢血よりのリケッチアDNAの検出とその型別:患者17例中14例で末梢血単核球よりPCR法にてリケッチアDNAが検出可能であった。産物をHhaIで処理したところ10例が入江株、4例が平野株と同一のパターンを示した。14例全例が蛍光抗体法による血清型と一致した。HhaIにて平野株と同じパターンを示した4例中2例はHinfI、AluI処理にて平野株と異なるパターンを示した。この2例よりリケッチアを分離しマウスに対する病原性を検討したところ平野株より弱毒であった。
[結論]本法ではPCRにて増幅した産物をHhaI処理することで分離株だけでなく患者末梢血よりリケッチアを分離することなく血清型の鑑別が可能であった。さらにHinfI、AluI処理することで検討した5株以外のDNA型のリケッチアの同定が可能であった。現在さらに検体を増やしてDNA型を検討するとともに、検討した5株と異なるDNA型を示す株の免疫学的性状を検討中である。