ヒト増殖細胞核抗原の構造と機能の解析

• Project/Area Number: 06772121
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Biological pharmacy
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 森岡 弘志 北海道大学, 薬学部, 助手 (20230097)
• Project Period (FY): 1994
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1994)
• Budget Amount: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 1994: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
• Keywords: 増殖細胞核抗原 / 複製因子C / DNAポリメラーゼδ / 蛋白質工学 / DNA複製 / T7RNAポリメラーゼ

Research Abstract

ヒト増殖細胞核抗原(PCNA)の構造-機能相関の解明を目的として、蛋白質工学的手法により作製したヒトPCNA変換体とRF-C(複製因子C)およびDNAポリメラーゼδとの相互作用を調べた。以下に、本研究によって得られた新たな知見等の成果を示す。
1.T7RNAポリメラーゼ系を用いたヒトPCNA発現用プラスミドを構築し、大腸菌内でヒトPCNAを大量発現させた。各種カラムクロマトグラフィーを用いて精製し、培養液1L当たり約30mgのPCNA蛋白質を得ることができた。
2.PCR法を応用した部位特異的変異法により、ヒトPCNA遺伝子に変異を導入した。標的部位は生物間で高いホモロジーを示す29種の酸性または塩基性アミノ酸とし、これらをすべてアラニンに変換した。上記と同様の方法で、これらPCNA変換体を得た。
3.RF-CおよびDNAポリメラーゼδとの相互作用を調べたところ、以下のことが示された。(1)C末端のLys254〜Glu259からなる領域はRF-CのATPase活性を促進するのに重要であった。(2)いくつかの酸性または塩基性アミノ酸はDNAポリメラーゼδのDNA合成活性の促進やRF-CのATPase活性の促進に関与していた。このうち9個所の塩基性アミノ酸残基(Lys13、Lys14、Lys20、Lys77、Lys80、Arg146、Arg149、Arg210、Lys217)は、予想されたリング状構造の内側のα-ヘリックス領域にほぼ一致しており、DNAと相互作用すると推定された。しかしながら、上記の活性が完全に失われたPCNA変換体を得ることはできなかった。すなわち、PCNAの複数のアミノ酸残基がDNAポリメラーゼδ、RF-CあるいはDNAと協同的に相互作用している可能性が考えられた。