グルタチオン非依存型ホルムアルデヒド脱水酵素の構造と反応機構の解明

• Project/Area Number: 06772137
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Biological pharmacy
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 伊藤 潔 長崎大学, 薬学部, 助教授 (50201926)
• Project Period (FY): 1994
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1994)
• Budget Amount: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 1994: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
• Keywords: ホルムアルデヒド脱水素酵素 / アルコール脱水素酵素 / グルタチオン / クローニング / 部位特異的変異 / システイン残基 / 亜鉛

Research Abstract

P.putida FDH(PFDH)にはグルタチオン(GSH)の代わりの機能を果たすシステイン残基が存在すると考えられる。亜鉛含有型ADHファミリーとの構造比較から、PFDHに存在する7個のシステイン残基のうち、PFDHに特有なCys-166および-257と活性中心の亜鉛に配位する可能性のあるアミノ酸残基としてAsp-169に着目し、それぞれを他のアミノ酸残基に変換した変異酵素を作製した。Cys-257のセリンへの変異体C257Sは野生型酵素と区別することができず、Cys-257は活性には関与しないことが判明した。Cys-166の変異体はいずれも不溶性となり酵素の構造維持に重要であることが分かった。Asp-169については、システイン残基への変換体D169Cにわずかながら活性が認められたことから、予想どおり活性中心亜鉛のリガンドである可能性があるが、D169AはCys-166の変異体と同様に不溶性となり明確な結論は得られていない。またクローン化した大腸菌の酵素(EFDH)の遺伝子(後述)を用いて、NAD結合領域で組み換えたキメラ酵素も不溶性であるので、現在のところ、PFDHにおいては、3番目の亜鉛リガンドとしてシステインではなくアスパラギン酸(Asp-169)が機能しており、その結果、近傍に位置するCys-166がGSHの代わりの機能を発揮するようになったのではないかという仮説を立てている。今後、より限定した領域で組み換えたキメラ酵素の構築とSH修飾試薬を用いたタンパク質レベルの解析を行っていく予定である。
GSH非依存型であるPFDHの研究と並行してGSH依存型であるEFDHについて、遺伝子のクローニングを行った。高く保存されているアミノ酸配列からオリゴヌクレオチドプライマーをデザインし、PCRによって遺伝子断片を増幅した。これをプローブとして小原らの大腸菌整列クローンライブラリーからハイブリダイゼーション法によって遺伝子全体を単離した。常法によりサブクローニングし、野生株の100倍以上のFDH活性を示すクローンを作製し、大腸菌染色体上のEFDH遺伝子の位置を8.2minと決定した。