神経成長抑制因子GIFの受容体の同定とクローニング

• Project/Area Number: 06780519
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Functional biochemistry
• Research Institution: National Institute for Environmental Studies
• Principal Investigator: 石堂 正美 国立環境研究所, 環境健康部・病態機構研究室, 主任研究員 (60211728)
• Project Period (FY): 1994
• Project Status: Completed (Fiscal Year 1994)
• Budget Amount: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 1994: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
• Keywords: 神経成長抑制因子 / GIF / バキュロウイルス発現系

Research Abstract

本研究では、神経成長抑制因子GIFの受容体を同定し、クローニングすることを目的とした。私たちは、GIF受容体をExpression Cloning法でクローニングすることを計画し、このプロジェクトをスタートした。なぜなら、このクローニング方法ではGIF受容体タンパク質の情報を必要としないからである。必要になってくるのはリガンドGIFの大量供給のシステムを確立することである。68個のアミノ酸からなり、システインに富むGIFを化学合成することは不可能である。他の選択は、組み換え体を利用することである。一般に用いられている大腸菌による生産では、構造上、活性の高いタンパク質は得にくい。実際、大腸菌で生産したGIFは天然のもと比較すると、その活性は一桁落ちる。そこで残された選択は、バキュロウイルス発現システムの利用である。本年度は、受容体研究に欠かせない良質のリガンドGIFを大量に供給するためのバキュロウイルス発現システムの確立に終始した。具体的には次のとおりである。
1.バキュロウイルス発現系によるヒト組み換え体GIFタンパク質の発現と精製
ヒトGIFcDNAをtransfer vectorpBKblueに組み込み、発現ベクターを構築した。発現後の精製を容易にするために3'末側に6個ヒスチジンをPCR法を用いて導入した。この発現ベクターをリン酸カルシウム法を用い蚕核多角病ウイルスDNAとともに昆虫細胞BmN4に導入した。この過程でGIFを組み込んだ発現ベクターはホモロガスリコンビネーションによりウイルスDNAに組み込まれることが期待される。用いたtransfer vectorが1acZ遺伝子を持つことを利用し、組み換え体ウイルスを精製した。感染操作を繰り返し、ウイルスのタイタ-を十分あげた。BmN4細胞での発現は、RT-PCR法により確認された。また、現在発現システムの系を拡大し、ニッケルカラムを用いてGIFタンパク質を精製している最中である。以上の研究成果はBiochem.Biophys.Res.Commun.誌に投稿予定である。