| Project/Area Number |
06807083
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| Research Category |
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
内分泌・代謝学
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
置村 康彦 神戸大学, 医学部・附属病院, 助手 (30204100)
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| Project Period (FY) |
1994
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 1994)
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| Budget Amount *help |
¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
Fiscal Year 1994: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
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| Keywords | プロラクチン遺伝子 / Pit1 / Oct1 / 下垂体 / 転写因子 |
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| Research Abstract |
本研究の目的は、Pit1と協同してPRL遺伝子の発現を促進する未知の因子を同定することであった。まず、この未知の因子が、PRL遺伝子のPit1結合DNA配列と直接作用するのか否か検討した。酵母の転写因子であるGal4のDNA結合ドメインにPit1を結合させたフュージョン蛋白の発現ベクターと,Gal4結合DNA配列をもつレポーター遺伝子とをCos細胞にトランスフェクトしたとき、cAMPによって、レポーター遺伝子の活性化は認められなかった。一方、Gal4のDNA結合ドメインにCREBを結合させたフュージョン蛋白の発現ベクターを用いて対照実験を行ったところ、cAMP刺激によって、Gal4レポーター遺伝子は活性化された。以上の成績は、Pit1存在下に起こる、cAMPによる未知の因子を介する遺伝子の活性化には、Pit1結合DNA配列が必要であることを示している。即ち、この未知の因子は直接Pit1結合DNA配列に結合する可能性が示唆された。そこで、実際にPit1結合DNA配列にCos細胞核抽出物が結合するか検討した。Cos細胞から核蛋白を調製し、P1(PRL遺伝子で最も転写開始点に近いPit1結合DNA配列)をプローベとして、mobility shift assayを行ったところ、2本のバンドが認められた。両者とも過剰量のコールドP1を加えた時、認められなくなったことから、Pit1結合DNA配列に特異的な結合蛋白であると考えられた。Pit1以外に、種々の細胞に存在する転写因子であるOct1が、P1に結合することが知られているので、Oct1抗体をこの系に加えたところ、移動度の遅いバンドは消失したが、移動度の早いバンドに変化はみられなかった。Pit1抗体の添加では、どちらのバンドも影響を受けなかった。以上の結果から、Pit1でもOct1でもない未知の蛋白がPit1結合DNA配列に特異的に結合することが示された。現在、この蛋白をクローニングすることを目的に、P1をプローベとして、サウスウェスタン法で,Cos細胞cDNA Libraryをスクリーニング中である。
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